高分文章揭示细胞核circRNA新机制
栏目:最新研究动态 发布时间:2018-05-22
环状RNA(Circular RNA, CircRNA)主要在细胞浆中富集,只有少数定位于细胞核......

高分文章揭示细胞核circRNA新机制

   很多人都会有这样的疑问, circRNA定位在细胞核中吗?其实,环状RNA(Circular RNA, CircRNA)主要在细胞浆中富集,只有少数定位于细胞核。目前文章报道的circRNA 主要定位于细胞质中,通过ceRNA机制发挥作用。那么细胞核中的circRNA 又具有什么功能呢?4月3日,知名免疫杂志Immunity (IF=22.8)发表了中科院生物物理所范祖森教授课题组的文章,首次报道 circRNA Cia-cGAS(作者以结合的蛋白命名)定位于细胞核中,通过结合cGAMP合成酶cGAS并抑制其酶活性,降低IFNs表达,维护静息状态的长效造血干细胞(LT-HSC)免受耗竭。(文章题目:A Circular RNA Protects Dormant Hematopoietic Stem Cells from DNA Sensor cGAS-Mediated Exhaustion)。

 

   成人造血干细胞(HSC)在骨髓内多以静息状态存在,同时保持着自我更新和分化的潜能,自我更新与分化稳态的破坏会导致骨髓衰竭或血液恶性肿瘤。长期造血干细胞(Long-term HSCs , LT-HSCs)作为潜能最高的干细胞系,为短期造血干细胞(ST-HSC)、多能干细胞(MPP)等祖细胞提供了持续性细胞补给。然而,HSCs如何维持其静息状态,并避免I型干扰素(IFN)介导的衰竭尚未清楚。

研究路线:

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1确定目标circRNA

为研究circRNAs对HSCs自我更新的影响,作者采用小鼠circRNA芯片在LT-HSCs 和MPPs两种细胞中筛选差异表达circRNA,结果发现49个circRNA 在LT-HSCs中上调 (A),RT-PCR验证到9个上调circRNA (B);northern blot鉴定这些circRNA (C)后, 进一步将这9个circRNA对应的 shRNAs 慢病毒移植小鼠发现只有Cia-cGAS影响HSCs的亚群分布 (D,E,F,G),同时确定干扰母基因线性RNA并无明显表型。接下来就是在小鼠不同组织,不同类型细胞中通过northern blot 和RT-PCR(一对convergent引物、一对divergent引物)验证Cia-cGAS的存在性,普遍性和保守性 (H,I,J)。并通过FISH和核质分离PCR发现Cia-cGAS位于细胞核中(K,L),其对应线性RNA位于细胞质而(附图)。

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2.Cia-cGAS具有哪些功能?(维持LT-HSCs的静息状态)

作者通过迷你系统迷你基因载验证Cia-cGAS序列上下游内含子中的反向互补序列是成环的关键,因此在内含子反向互补序列处设计引物,通过CRISPR/Cas9在小鼠内进行Cia-cGAS敲除 (A,B,C)。分离小鼠骨髓HSC细胞通过流式确定敲除Cia-cGAS后LT-HSCs细胞数和百分比下降(D,E,F),且成熟的造血细胞数量也下降(H),骨髓切片HE染色发现有核细胞减少(G)。同时BrdU腹腔注射小鼠后流式分析LT-HSCs的BrdU信号,发现Cia-cGAS敲除后BrdU信号增强(I);细胞周期分析LT-HSCs表明现,Cia-cGAS敲除处于S/G2/M活跃状态的后LT-HSCs细胞数增多 (J)。这些结果表明Cia-cGAS维持LT-HSCs的静息状态。

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3.Cia-cGAS通过哪些基因调控LT-HSCs的静息状态 ?(IFN)

确定circRNA 功能后,接下来作者研究其作用机制。通过mRNA芯片在cia-cGAS+/+ 和cia-cGAS–/– LT-HSCs中筛选差异表达基因(A)。筛选上调的已报道调控HSC活跃状态的IFN。并通过PCR 和ELISA 验证IFN的表达(B,C). 通过回复实验,确定IFN敲除 后能回复cia-cGAS敲除造成的静息破坏(E,F,G,H)

 

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4.Cia-cGAS通过什么机制调控IFN?  (结合蛋白cGAS)

因为Cia-cGAS位于细胞核中,所以其可能通过结合蛋白(如:酶类,转录因子)来调控mRNA的合成。作者以Cia-cGAS对应的线性RNA为探针进行RNA pull down,通过质谱筛选拉下的蛋白(A),筛选到已报道通过合成GAMP, 而调控IFN 的合成酶cGAS。进一步,通过特异抗体WB 和RIP验证(B,C). 接下来确定Cia-cGAS和cGAS共定位:免疫荧光,质分离WB,和免疫荧光共定位(D,E,F).  进一步确定结合位点:生物信息学分析Cia-cGAS对应线性RNA的二级结构(G), 位点突变后进行EMSA 和AlphaScreen (H,I,J,K)

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5.Cia-cGAS 对结合蛋白的调控? (抑制其酶活性)

cGAS 通过结合DNA,催化cGAMP合成。因此作者研究Cia-cGAS结合cGAS对其结合DNA能力的影响。通过竞争性EMSA试验,对cGAS孵育不同量的Cia-cGAS看其结合DNA 的能力变化(A),并反面验证(B); 同时用RNA pull down 和DNA pull down 验证 (C,D)。通过TLC,ChIP, reverse phase-HPLC,luciferase assay 验证Cia-cGAS敲除对cGAMP合成的影响 (E,F,G,H).

6.Cia- cGAS /结合蛋白/靶基因 对LT-HSCs静息状态和免疫的调控

最后就是调控通路回到细胞表型上,通过回复性试验进行验证。联合敲除Cia-Cgas/和结合蛋白后,实验方法跟功能研究实验一样。

7.Cia- cGAS作用机制图


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