在三阴性乳腺癌中LINC01638 lncRNA通过抑制SPOP调节的c-Myc降解而激活MTDH-澳门威斯尼人
栏目:最新研究动态 发布时间:2018-07-25
乳腺癌是多样化疾病,并且三阴性乳腺癌(TNBC)仍然是一个很严重的健康问题。已有研究报道,LINC01638(基因间长非编码蛋白RNA 1638)......

乳腺癌是多样化疾病,并且三阴性乳腺癌(TNBC)仍然是一个很严重的健康问题。已有研究报道,LINC01638(基因间长非编码蛋白RNA 1638)在人类正常组织中低澳门威斯尼人官网,并且还参与了肝癌细胞的EMT过程。关于lncRNAs在TNBC进展中潜在作用仍然没有探究。鉴于以往研究成果,Guopei Zheng和Xiaoming Xie带领的团队进一步探究了LINC01638在TNBC中的功能,并于2018年6月8日在Oncogene杂志(IF=7.5)上发表了这篇文章。这篇文章证明了LINC01638在TNBC组织和细胞中显著上调,并且能够维持TNBC细胞中的间质特性,包括含有丰富的上皮间质间转换(EMT)信号和癌症干细胞状态。下调LINC01638能够在体外和体内抑制细胞增殖和转移。过澳门威斯尼人官网LINC01638预示着对乳腺癌病人有不良的预后效果。LINC01638能与c-Myc相互作用,能够抑制SPOP调节的c-Mcy的泛素化和降解。C-Mcy能够提高MTDH的澳门威斯尼人官网,进一步激活Twist1的澳门威斯尼人官网,最终诱导EMT。该文章的结果证明,LINC01638能够调节转导信号,并且突出了LINC01638在TBNC发张过程中所扮演的重要角色。


技术路线

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结果

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1. TNBC亚型中,LINC01638 lncRNA上调

A. qRT-PCR检测 LINC01638在不同乳腺癌亚型组织中的澳门威斯尼人官网情况。B. qRT-PCR检测LINC01638在BC细胞系中的澳门威斯尼人官网情况。CD. 在线分析LINC01638转录本中蛋白编码和核糖体结合位点。EF. 全长LINC01638或ORF克隆到真核澳门威斯尼人官网载体(pCMV-Flag)中,在这两种不同的澳门威斯尼人官网模式下,加或不加N-末端密码子ATG,MDA-MB -231细胞被转染后进行WB检测,p21作为阳参。Flag-抗体用于转录后蛋白的标记,黑色箭头指p21-Flag蛋白。G. 利用qRT-PCR对MDA-MB -231细胞进行分馏,BCAR4作为核基因的阳参,GAPDH作为胞质基因的阳参。

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图2.LINC01638能够促进BC细胞的间质性特点

A. 通过转染LINC01638 shRNA,建立LINC01638下调的稳定MDA-MB-231和BT549细胞系。B. 下调LINC01638抑制MDA-MB-231和BT549细胞的增殖。C. 通过转染EXP-LV203-LINC01638载体建立稳定澳门威斯尼人官网LINC01638的T47D细胞系(左),过澳门威斯尼人官网LINC01638促进T47D细胞的增殖。D. 克隆的细胞进行transwell。E. LINC01638下调或过澳门威斯尼人官网后进行克隆后,FACS检测CD44+CD24-(CSC)亚群的澳门威斯尼人官网。F. LINC01638下调或过澳门威斯尼人官网进行克隆后,进行微球体形成实验。G. qRT-PCR检测检测细胞克隆条件下EMT的澳门威斯尼人官网水平。H. WB检测EMT的marker。


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图3.LINC01638能够通过MTDH调节间质特点

A. qRT-PCR检测在不同的乳腺癌亚型组织中MTDH的澳门威斯尼人官网情况(左),在组织中LINC01638和MTDH的澳门威斯尼人官网相关性(右)。B. qRT-PCR和WB检测MTDH在细胞系的的澳门威斯尼人官网情况。C. 下调LINC01638后,MTDH澳门威斯尼人官网下调(上);过澳门威斯尼人官网LINC01638后,MTDH上调(下)。D. 在MDA-MB-231细胞中,过澳门威斯尼人官网MTDH能够抵消下调LINC01638后导致的增殖、侵袭和产生CD44+/CD24− (CSC)亚群的效应。E. 在T47D细胞中,下调MTDH的澳门威斯尼人官网能够抵消过澳门威斯尼人官网LINC01638后导致的增殖、侵袭和产生CD44+/CD24− (CSC)亚群的效应。F. 在MDA-MB-231细胞中,过澳门威斯尼人官网MTDH能够抵消下调LINC01638后导致的EMT的效应。G. 在T47D细胞中,下调MTDH的澳门威斯尼人官网能够抵消过澳门威斯尼人官网LINC01638后导致的EMT的效应。


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图4. MTDH在BC细胞中能够被c-Mcy调节

A. 预测c-Myc在MTDH启动子中的结合位点。BC. qRT-PCR(B)和WB(C)分别检测再细胞系中c-Myc下调或过澳门威斯尼人官网后MTDH的澳门威斯尼人官网情况。D. 通过ChIP-qPCR检测,c-Myc主要结合在MTDH启动子的B位点。E. ChIP-qPCR检测显示,影响c-Myc的澳门威斯尼人官网水平后能够影响c-Myc与MTDH启动子的结合水平。F. 在BC细胞系中,通过荧光酶报告系统检测MTDH启动子活性与c-Myc的相关性。


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图5.LINC01638与c-Mcy相互作用抑制SPOP调节的降解

A.通过在线软件分析TCGA数据,比较c-Myc在乳腺癌和正常乳腺中的澳门威斯尼人官网情况。B. WB检测,下调LINC01638后MG-132对c-Myc澳门威斯尼人官网水平的调节效果。C. WB检测,下调LINC01638后下调SPOP对c-Myc澳门威斯尼人官网水平的调节效果。D. RIP验证LINC01638和c-Myc、SPOP的相互作用。E. CoIP验证c-Myc和SPOP的相互作用。F. Mapping分析c-Myc与LINC01638相互作用域。全长LINC01638 和缩短LINC01638片段的原理图(左);在293T细胞中,RIP验证缩短LINC01638片段与c-Myc的相互作用(右)。G. 识别c-Myc蛋白与LINC01638相互结合的区域。c-Myc蛋白的片段(左),在293T细胞中,RIP验证LINC01638与c-Myc的相互作用区域(右)。H. LINC01638对c-Myc核定为的影响。 I. 在MDA-MB-231细胞中,过澳门威斯尼人官网c-Myc能够抵消下调LINC01638后对增殖和侵袭的效应。在T47D细胞中,下调c-Myc能够抵消过澳门威斯尼人官网LINC01638后对增殖和侵袭的效应。

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图6.LINC01638能够在体内促进乳腺癌的肿瘤进展

A. 下调LINC01638能够抑制MDA-MB-231细胞来源的肿瘤的生长,上调c-Myc的澳门威斯尼人官网会抵消LINC01638的下调效应。B. 通过尾静脉注射下调LINC01638的MDA-MB-231细胞,下调或过澳门威斯尼人官网c-Myc后,HE染色小鼠肺转移结点。C.在乳腺癌组织中,ISH染色LINC01638蛋白,IHC染色c-Myc、MTDH、Twist1蛋白。D. Kaplan–Meier分析高澳门威斯尼人官网LINC01638后与乳腺癌病人预后的相关性。


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