Drosophila tsRNAs preferentially suppress general translation machinery via antisense pairing and participate in cellular starvation 澳门威斯尼人
栏目:最新研究动态 发布时间:2018-08-24
转运RNA衍生的小RNA(tsRNA)是一类新兴的小RNA,但它们的调节作用尚未得到很好的理解。近日,北京生命科学中心......

转运RNA衍生的小RNA(tsRNA)是一类新兴的小RNA,但它们的调节作用尚未得到很好的理解。近日,北京生命科学中心陆剑研究组在Nucleic Acids Research(IF=11.561)研究发表了tsRNA介导的果蝇调节的分子机制和后果。通过分析495个公共小RNA文库,他们证明了这些RNA在果蝇中是保守的,普遍存在的。通过对单链tsRNA模拟和模拟转染的S2细胞进行mRNA测序和核糖体分析,他们发现tsRNA通过保守的互补序列匹配识别靶mRNA,并通过澳门威斯尼人抑制抑制靶基因。目标预测表明tsRNA优先抑制一般澳门威斯尼人机制的关键组分的澳门威斯尼人,这解释了tsRNA如何抑制全球mRNA澳门威斯尼人。血清饥饿实验证实tsRNA通过优先靶向核糖体蛋白和澳门威斯尼人起始或延伸参与细胞饥饿反应。在正常和饥饿条件下敲除S2细胞中的AGO2揭示了tsRNA介导的调节对AGO2的依赖性。他们还通过荧光素酶报告基因检测验证了代表性tsRNA对细胞全局澳门威斯尼人和特定靶标的抑制作用。他们的研究表明,tsRNA介导的调节可能对细胞系统中的能量稳态和代谢适应至关重要。

 

技术路线

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主要结果

1.果蝇中,tsRNA对果蝇的小RNA表达谱有显着贡献。

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 图1 tsRNA在果蝇中是保守的,丰富的和普遍的

(A)tsRNA reads和miRNA reads在个体不同的发育组织中的比率。字母代表每个部位(胚胎、幼虫、蛹、头、体、睾丸和卵巢)的首字母缩写。还显示了tsRNA reads与所有基因组图谱reads的平均比率,不包括rRNA,snRNA和snoRNA(红线)。(B)单个20-22nt tsRNA种类(N = 1725,RPM> 1)的标准化丰度在D. melanogaster(x轴)和果蝇(y轴)中共享,以百万分之一(RPM)测量。(C)在不同发育类别的小RNA文库中,总tsRNA(20-29nt)中的短tsRNA(20-23nt)的百分比。字母定义与A相同。(D)tsRNA长度在AGO1、AGO2、AGO3、AUB和PIWI-IP文库中的分布。(E)每个文库中成熟tRNA上每个核苷酸位置的tsRNA的相对覆盖率(N = 495)。

 

2.果蝇tsRNAs可能抑制全局mRNA的澳门威斯尼人,并且通过保守的反义匹配调节靶基因的澳门威斯尼人。

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图2将tsRNA模拟物转染到S2细胞中抑制全局澳门威斯尼人活性

(A)在成熟tRNA中三种tsRNAs tsRNA AspGUC(T3),tsRNA GluCUC(T6)和tsRNA LysUUU(T10)的结构的示意图。 tsRNA为红色,反密码子为蓝色。(B)使用来自没有任何RNA序列(模拟,黑色)转染的S2细胞的10 45%蔗糖梯度分离的RNA的吸光度曲线(在UV波长254nm处),具有阴性对照小RNA(ss-NC,橙色), tsRNA T3(红色),T6(绿色)或T10(蓝色)。(C)多核糖体分区(P)内的聚集强度与单体分区(M)的比率通过对照实验的中值归一化。 星号表示转染和模拟之间显着不同的P / M比率。(D)Ribo-seq reads的散点图对T3转染实验中各个基因的mRNA-seq reads计数。 蓝色圆圈代表具有> 50个mRNA-seq读数和> 50个Ribo-seq读数的基因。

 

3.果蝇tsRNAs通过保守的反义匹配调节靶基因的澳门威斯尼人。

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图3 tsRNA通过反义配对抑制靶mRNA的澳门威斯尼人

(A)所有基因的澳门威斯尼人效率(TE)变化的累积分布。 x轴是用tsRNA模拟物转染的S2细胞中的log 2(FC TE)(从左到右的T3,T6,T10)与用ss-NC转染相比。具有7-mer位点的基因在果蝇(Drosophila melanogaster)和果蝇(Drosophila virilis)之间保守,与tsRNA的任何部分配对的反义基因被定义为tsRNA靶基因。红色,绿色,蓝色,灰色分别表示具有一个,两个,两个,0个以上保守的tsRNA靶位点的基因。每个类别中的基因数量用括号表示。星号表示与ss-NC对照组相比TE FC的显着差异。(B)tsRNA的抑制效率与mRNA转录物中tsRNA靶位点的位置无关“No sites”:没有保守的tsRNA靶位点的mRNA;其他依次表示有在该区域有保守的位点。每个类别中的基因数量在括号中给出。(C)显示tsRNA反义配对与mRNA的不同位置中的进化上保守的7聚体靶位点(红色)的方案。

 

4.AGO2结合的tsRNA优先抑制一般澳门威斯尼人机制的组分。

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图4 tsRNA以AGO2依赖性方式介导澳门威斯尼人抑制

(A)对AGO2结合的tsRNA的前600个靶基因的GO分析。与澳门威斯尼人相关用红色表示。(B)AGO2结合的tsRNA对RpS9 mRNA的靶位点密度。 y轴是每个靶位点的-log 2(AGO2结合的tsRNA的reads)。(C)在正常条件下培养的AGO2敲低与ds-NC转染的S2细胞中的TE的log 2(FC)。(D)在敲除AGO2后,mRNA中的tsRNA靶位点的密度(x轴)与澳门威斯尼人去抑制(y轴)的程度正相关。 在该分析中使用AGO2结合的tsRNA的前351个靶标。 RP / IEF以红色显示(N = 48)。

 

5.tsRNA参与细胞饥饿反应。

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图5 tsRNA参与果蝇细胞饥饿反应

(A)血清饥饿反应中每种tRNA类型5’,中间,3’ tsRNA丰度。(B)来自5’,中间,3’ tsRNA中tsRNA丰度的变化是不同。 血清饥饿下的上调显示为蓝色,血清饥饿下的下调显示为红色。 y轴是三种类型的tsRNA中上调/下调的tsRNA的百分比。(C)正常和饥饿的S2细胞中tsRNA的丰度(RPM)。 不受AGO1和AGO2结合的tsRNA为灰色,仅由AGO2结合的tsRNA为红色,仅由AGO1结合的tsRNA为黑色,由AGO1和AGO2结合的tsRNA为橙色。(D)在S2细胞的四种不同条件下对AGO2进行Western印迹。 S2细胞的四种条件:在正常条件下培养,血清饥饿,血清饥饿下AGO2敲低,和AGO2敲低。

 

6.tsRNA和miRNA介导的调节在很大程度上是独立的。

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图6 tsRNA抑制细胞饥饿反应中靶基因的澳门威斯尼人

(A)通过上调的AGO2结合表现出更高的靶位点的mRNA(UpSitesscore,x-轴)和经过基因澳门威斯尼人的表达(y轴)相关性。显示了Spearman的相关性和P值。(B)由上调的AGO2结合的tsRNA靶向的基因(UpSites得分> 3 / kb,N = 408)在饥饿的S2细胞中降低了TE。(C)FC TE(log 2 scaled,y轴 血清饥饿下的5’TOP基因)和UpSites得分(x轴)之间的显着负相关(N = 115)。(D)在正常(左)和正常(左)和下饥饿的S2细胞(UpSites> 3和5’TOP基因未包括,N = 376)中上调的tsRNA的最高得分靶基因的TEs(y轴)的变化。

 

7.得到一个tsRNAs如何抑制特异性靶标和全局mrna澳门威斯尼人的模型。

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图7 tsRNA如何抑制特定靶标和全局mRNA澳门威斯尼人的模型

(A)本研究中S2细胞砂测序工作流程的实验处理概述。(B)tsRNA通过反义配对优先靶向RP和IEF以调节全局澳门威斯尼人活性。(1)AGO2结合从tRNA切割的tsRNA,并且那些tsRNA特异性结合具有部分互补性的mRNA并抑制它们的澳门威斯尼人。(2)在饥饿的情况下,澳门威斯尼人抑制也受mTOR途径调节5’ TOP基因和一些tsRNA靶标与5’ TOP基因(绿色)。(3)一些RP和IEF的澳门威斯尼人被tsRNA压制,这反过来抑制了全球澳门威斯尼人活动。

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图8 使用双荧光素酶报告基因检测验证tsRNA对全局澳门威斯尼人活性和特定靶位点的抑制作用

(A)将tsRNA模拟物和psiCHECK-2质粒共转染到S2细胞中降低了萤火虫荧光素酶的活性。颜色键显示tsRNA模拟物的不同最终浓度。(B)较高浓度的tsRNA混合物在psiCHECK-2质粒上引起较低的萤火虫(红色)和海肾(蓝色)荧光素酶活性。 *** P <0.001(每次测定进行三次重复)。(C)tsRNA T16与RpL8和PpL27 mRNA中预测的靶向位点之间的碱基配对。靶位点两侧的侧翼5bp(以青色突出显示)包括在合成的靶向位点中。(D和E)用T16共转染的S2细胞和含有靶位点的psiCHECK-2质粒(RpL8,D; RpL27,E)的相对荧光素酶活性显着低于用ss-NC和相同质粒共转染的那些质粒。

 


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