体内定时炸弹的引线——lncRNA H19与腹澳门威斯尼人瘤
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-05-31
腹澳门威斯尼人瘤是一种腹部澳门威斯尼人异常扩大的病变,宛如深藏体内的“定时炸弹”,这枚埋在体内的“定时炸弹”的危险性使得它逐渐得到重视……

   腹澳门威斯尼人瘤(AAA)是一种腹部澳门威斯尼人异常扩大的病变,其发病隐秘,致死率高,破裂后如不经救治,24小时生存率小于50%,而总死亡率则高达85%~95%,宛如深藏体内的“定时炸弹”。这枚埋在体内的“定时炸弹”的危险性使得它逐渐得到重视,许多学者将如何治疗它当做一个值得攻克的难题,寻找诱发其发展因素。                                                                        

今年4月,Dr. Yili Sun等人在杂志《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》上发表了一篇名为“LncRNA H19 promotes vascular inflammation and abdominal aortic aneurysm formation by functioning as a competing endogenous RNA”的文章,文章介绍了LncRNA H19 如何促进血管炎症进而诱导腹澳门威斯尼人瘤形成的,为治疗AAA提供了一个新的研究方向。
背景:腹澳门威斯尼人瘤(AAA)被认为是一种慢性血管炎症性疾病。然而,在整个腹澳门威斯尼人瘤形成的过程中,炎症反应是如何被调控的尚不完全清楚。

结果:qRT-PCR检测到H19在人类与小鼠组织样本中的表达上调。H19和巨噬细胞标识物MAC-2的共染色显示H19位于血管平滑肌细胞(VSMCs)和浸润的澳门威斯尼人巨噬细胞中。H19在体内的过表达增强了血管炎症并诱导AAA形成,其支持因素有澳门威斯尼人形态恶化,澳门威斯尼人最大直径值、弹性蛋白降解、白细胞介素-6 (IL-6)和巨噬细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)表达以及巨噬细胞浸润。 H19抑制表现出了相反的效果。解救实验表明,IL-6中和作用能显著缓和因H19过表达诱发的澳门威斯尼人炎症和AAA的形成。荧光素酶报告分析和体外实验利用VSMCs和巨噬细胞证明,H19与let-7a microRNA内源性竞争诱导其靶基因IL-6的转录,在一定程度上诱导动脉瘤形成。这个机制通过利用不能与let-7a有效结合的突变体H19的体内实验进一步证实。

结论:本研究揭示了AAA形成过程中一条致病性H19/let-7a/IL-6炎症通路,并为AAA的治疗提供了一种潜在的新策略。
研究结果:


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Figure 1.H19在人类澳门威斯尼人瘤样品和Ang II-、CaC12-诱导的小鼠澳门威斯尼人中再表达

A到C,人澳门威斯尼人IL-6(A),MCP-1(B)和H19(C)表达水平的qPCR结果(n=5)。连续28天给雄性ApoE-/-小鼠灌注Ang II (1μg/kg/min)或等量生理盐水。D,小鼠澳门威斯尼人H19表达的qRT-PCR分析(n=5)。E,在澳门威斯尼人连续样本片段中,H19的原位杂交复合染色和巨噬细胞的免疫荧光染色(MAC-2)(n=5)。雄性C57BL/6J小鼠肾澳门威斯尼人上用CaCl2纱布或生理盐水纱布处理15分钟。3周后进行检测。F,小鼠澳门威斯尼人H19水平的qRT-PCR结果(n=5)。G,H19的原位杂交复合染色和巨噬细胞的免疫荧光染色(MAC-2) (n=5)。数据以三次独立实验的平均值±SD表示,**P<0.01.

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Figure 2.在Ang II-治疗的 ApoE-/- 小鼠中,H19的减少阻止了AAA的形成
用Scr-RNA或Sh-H19转染雄性ApoE-/-小鼠(每组25只)。三十天后,再连续28天注入Ang II。生理盐水,连续28天给雄性ApoE-/-小鼠灌胃与生理盐水等量的假生理水(每组10例)。A,澳门威斯尼人宏观特征的代表图像。B,澳门威斯尼人的二维超声和彩色多普勒成像。C,AAA发生率的统计学分析(每组25例)。D,腹澳门威斯尼人最大直径(每组16例)。E,澳门威斯尼人中代表性的弹性蛋白染色和弹性蛋白降解评分。照片显示了弹性蛋白降解最严重的位置(每组n=15;比例尺:上200µm下50µm;放大的照片)。F,澳门威斯尼人MAC-2免疫荧光染色具有代表性(每组4例;比例尺:上200µm下50µm;放大的照片)。数据表示为平均值±SD或中位数和IQR(弹性蛋白降解评分)。 *P<0.05, **P<0.01

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Figure 3.在Ang II治疗的C57BL/6J小鼠中H19过表达诱导AAA形成

雄性C57BL/6J小鼠分别转染AAV-GFP或AAV-GFP- h19(每组25只)。30天后,再连续28天注入Ang II。生理盐水,连续28天给雄性C57BL/6J小鼠灌胃与生理盐水等量的假生理水(每组10例)。A,澳门威斯尼人宏观特征的代表性图像。B,澳门威斯尼人二维超声及彩色多普勒成像。 C,小鼠AAA发病率的统计分析(每组N=25)。D,腹澳门威斯尼人最大直径(每组16个)。E,澳门威斯尼人弹性蛋白染色及弹性蛋白降解评分具有代表性(每组n=15)。照片显示的位置发生最严重的弹性蛋白降解(比例尺:上200µm下50µm;放大的照片)。F,澳门威斯尼人MAC-2蛋白表达的代表性免疫荧光染色及统计学分析(n=4;比例尺:上200µm下50µm;放大的照片)。 数据表示为平均值±SD或中位数和IQR(弹性蛋白降解评分)。*P<0.05,**P<0.01。

 

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Figure 4. H19过表达促进CaCl2-治疗的C57BL/6J小鼠体内AAA的形成

雄性C57BL/6J小鼠在用CaCl2纱布处理肾上澳门威斯尼人前30天,分别注射病毒载体AAV-GFP- h19或AAV-GFP(每组n=25)。生理盐水,用等量生理盐水处理假生理盐水注射的雄性C57BL/6J小鼠(n=10)。CaCl2治疗3周后进行检测。A,AAA的代表性图片。B,腹澳门威斯尼人的最大动脉直径(每组n=10)。 C,病毒注射后澳门威斯尼人H19 RNA水平的统计分析(每组n=4)。 D,小鼠澳门威斯尼人弹性蛋白染色及降解评分具有代表性。照片显示了弹性蛋白降解最严重的地方(每组n=10;比例尺:上 200 µm,下50 µm; 放大的图片)。E,澳门威斯尼人MAC-2蛋白表达的代表性免疫荧光染色及统计学分析(每组n=4,比例尺:上200 µm,下50 µm;放大的图片)。数据表示为平均值±SD或中位数和IQR(弹性蛋白降解评分)。**P<0.01。

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Figure 5. H19在VSMCs中起着let-7a海绵的作用
A,H19与let-7a、IL-6与let-7a之间的潜在结合位点以及构建的突变体结合位点。B,荧光素酶报告基因检测结果。用功能性let-7a mimics或无效let-7a 类似物 (mimicNC)瞬时转染VSMCs。24h后,用含有野生型IL-6 (IL-6- WT)或突变型IL-6 (IL-6- MUT)的荧光素酶报告转染。24h后检测荧光素酶活性。 C,双荧光素酶报告基因检测结果。用功能性let-7a模拟物(let-7a mimics)或无效的let-7a模拟物(mimicNC) 瞬时转染VSMCs,然后用含有野生型(H19- WT)或突变体H19 (H19- MUT1, H19-MUT2)的荧光素酶报告转染。24h后检测荧光素酶活性。D,双荧光素酶报告基因检测结果。 瞬时转染功能质粒介导的H19转录本(pcDNA3.1-H19)或假转录本(pcDNA3.1-NC),选择性加入功能let-7a模拟物。之后,用含有野生型IL-6 (IL-6- WT)或突变型IL-6 (IL-6- MUT)的荧光素酶报告基因转染细胞。24h后检测荧光素酶活性。**P<0.01。实验四重复。

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Figure 6.澳门威斯尼人H19靶向并负向调节let-7a促进IL-6在VSMCs的表达

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Figure 7.较高的let-7a生物活性可延缓Ang II-治疗的C57BL/6J小鼠体内AAA的形成

雄性C57BL/6J小鼠转染AAV-H19或AAV-H19-mut(每组n=26)。30天后,他们又被注入Ang II,持续28天。A,澳门威斯尼人宏观特征的代表性图像。B,腹澳门威斯尼人最大直径(每组n=14)。C,AAA发生率统计分析(每组n=26)。D and E,澳门威斯尼人中代表性弹性蛋白染色(D)和弹性降解分数(E)。照片显示了弹性蛋白降解最严重的地方(每组n=14;比例尺:上200 µm,下50 µm;放大的照片)。 F and G,澳门威斯尼人MAC-2代表性免疫荧光染色(F)及其统计分析(G)(每组n=4;比例尺:上200 µm,下50 µm;放大的照片)。 H,血浆IL-6浓度(每组n=8)。数据表示为平均值±SD或中位数和IQR(弹性蛋白降解评分)。*P<0.05, **P<0.01。

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Figure 8. 证实IL-6在h19促进AAA形成过程中的炎症中介作用

用AAV-H19转染雄性C57BL/6J小鼠。30天后,随机给予托珠单抗(TCZ,一种针对IL-6受体的单克隆抗体)或等量的IgG(每组n=30)治疗。治疗24小时后,所有小鼠再灌注Ang II 28天,然后处死进行检查。A,两组宏观澳门威斯尼人代表图像。B,腹澳门威斯尼人最大直径(每组n=14)。C, AAA发生率统计分析(每组n=30)。D和E,澳门威斯尼人中代表性弹性蛋白染色(D)和弹性降解分数(E)。照片显示了弹性蛋白降解最严重的地方(每组n=14;比例尺:上200 µm,下50 µm;放大的照片)。F和G,澳门威斯尼人MAC-2代表性免疫荧光染色(F)及其统计分析(G)(每组n= 5;比例尺:上200 µm,下50 µm;放大的照片)。 数据以均数±标准差表示。*P<0.05,**P<0.01。


 

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