有了RNA-protein 相互作用的研究澳门威斯尼人官网,再也不愁高分的SCI文章了!
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-07-23
最新研究成果扩展了RNA-protein 相互作用的两大类澳门威斯尼人官网,由于每种澳门威斯尼人官网都有其优势和局限,选择最佳澳门威斯尼人官网来处理生物学问题变得非常重要......

      热门研究的非编码RNA,包含LncRNAs、snoRNAs和mRNA UTR,其许多功能是与RNA结合蛋白(RBPs)直接相互作用实现的。最近研究发现数百种新RBPs的RNA结合域尚不清楚,于是强调RNA蛋白复合物的复杂性和多样性,进而最新研究成果扩展了RNA-protein 相互作用的两大类澳门威斯尼人官网:一类澳门威斯尼人官网是以RNA为中心,研究与感兴趣的RNA结合的protein;另一类澳门威斯尼人官网是以蛋白质为中心,研究与感兴趣的protein结合的RNAs。由于每种澳门威斯尼人官网都有其优势和局限,选择最佳澳门威斯尼人官网来处理生物学问题变得非常重要。(Review,Methods to study RNA-protein interactions,IF=28.464)
一、以RNA为中心的澳门威斯尼人官网:发现与感兴趣的RNA结合的RBPs
1.以RNA为中心的澳门威斯尼人官网示意图

说明: IMG_256


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以RNA为中心的澳门威斯尼人官网又分体内澳门威斯尼人官网和体外澳门威斯尼人官网。
体外澳门威斯尼人官网:
      澳门威斯尼人官网a(1)是用于pull down 实验的RNA 5 '或3 ' RNA生物素化。末端生物素化RNA与streptavidin beads(链霉亲和素珠)结合,然后加入细胞提取物孵育后洗涤。此澳门威斯尼人官网不需要洗脱RNA,向beads加入SDS,煮沸,用于蛋白质组学分析。
      澳门威斯尼人官网a(2)是感兴趣的RNA加适体标签,例如,S1适体标签与streptavidin beads结合,生物素可以竞争性地结合streptavidin ,以洗脱标记有S1适体的RNA。已有文献报导,Cys4 核糖核酸内切酶可以结合Cys4 hairpin loop,用imidazole(咪唑)将核酸酶从发夹环上分离,释放结合RNA的RBPs。优缺点:降低了非特异性的结果。
      澳门威斯尼人官网a(3)标记Cy5染料的体外转录(IVT )RNA杂交到约9400个重组人蛋白(Human ProtoArray)的蛋白芯片。通过荧光检测结合Cy5 RNA的蛋白质。优缺点:Human ProtoArray澳门威斯尼人官网不需要细胞提取物,有助于发现RNA-protein 相互作用的一种研究澳门威斯尼人官网。然而,这类澳门威斯尼人官网限制于斑点蛋白的折叠结构和翻译后修饰以及浓度的改变。
体内澳门威斯尼人官网:
      甲醛是一种小的双功能交联剂,易渗透细胞并在2个单位内交联大分子,包括蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA和蛋白质-RNA复合物交联,这种交联是可逆的。UV light 交联是一种零距离交联且不可逆。与甲醛交联剂相比,UV light 不交联蛋白质-蛋白质相互作用,特异性强,但效率较低。
      澳门威斯尼人官网b(1)是通过蛋白-RNA交联进而鉴定体内的相互作用。具体内容是在变性条件下去除非共价相互作用来纯化RNA,生物素化寡核苷酸探针与感兴趣的RNA杂交, RNA和交联蛋白被纯化与鉴定。优缺点:效率低,细胞用量多。
      澳门威斯尼人官网b(2)RNA-蛋白质相互作用检测法简称RaPID (LN-HA-Bira),BoxB RNA茎环侧面结合感兴趣RNA,在含有生物素的培养基培养细胞,BoxB位点结合融合蛋白(λ-N ),融合蛋白引起与感兴趣RNA结合的蛋白生物素化,最后用streptavidin beads捕获生物素化的蛋白质。

澳门威斯尼人官网应用优点缺点
RNA生物素化SMN mRNARNA末端标记生物素,与链霉亲和素珠结合强在体外,可能偏好细胞提取物中丰富的蛋白质
S1适体ARE motif用生物素易洗脱RBP复合物从streptavidin beads在体外,可能偏好丰富的蛋白质
Cys4Pre-miRNA用咪唑洗脱RBP复合物在体外,可能偏好丰富的蛋白质
蛋白芯片TINCR, SNORD50不需要细胞提取物;不需要MS在体外,仅与微阵列上的蛋白质直接相互作用
RAPXist, FIRRE noncoding RNA体内;运用UV交联和长的寡核酸探针(120nt),特异性高耗费细胞量大
TRIPp27 mRNA, CEP-1 mRNA体内;紫外交联特异性高。Poly(A)和生物素化ASO的捕获使效率降低
PAIRANK mRNA体内;紫外交联特异性高。肽核酸生产耗费成本和精力
MS2-BioTRAPIRES体内;紫外交联特异性高。需要MS2与RNA的结合,RNA和标签蛋白的转染/感染,耗费细胞量大
CHARTXist, MALAT1, NEAT1体内需要RNase识别探针位置的;耗费细胞量大
ChIRPTERC, Xist体内,探针设计无需要特异性RNA短探针可能会拉下类似的片段序列;耗费细胞量大
RaPIDZIKV-宿主蛋白相互作用
3’端UTR Motifs
体内;所需细胞数量少;直接标记蛋白质需要BoxB与RNA连接;限制短序列;RNA和标签蛋白的转染/感染

二、以蛋白为中心的澳门威斯尼人官网:发现与感兴趣的蛋白质结合的RNAs
1.蛋白质纯化的澳门威斯尼人官网

说明: IMG_256


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      紫外交联免疫沉淀结合高通量测序(CLIP-seq)原理
  基于RNA分子与RNA结合蛋白在紫外照射下发生耦联,以RNA结合蛋白的特异性抗体将RNA-蛋白质复合体沉淀之后,回收其中的RNA片段,经添加接头、RT-PCR等步骤,对这些分子进行高通量测序,再经生物信息学的分析和处理、总结,挖掘出其特定规律,在体内与众多 RNA 靶标的结合模式,并揭示其在一些重要生物学过程中的功能,是一项在全基因组水平揭示 RNA分子与RBP相互作用的革命性技术。能够确定RBP与RNA直接的相互作用和精确的结合位点。
  CLIP-seq 的应用范围:
  (1)绘制全基因组范围的RNA和RBP相互作用图谱,解析“Argonaute(Ago)—miRNA—mRNA”三者的相互作用;
  (2)RBP与miRNA、lncRNA等非编码RNA的作用网络与功能的发现;
  (3)与 RIP-seq 相比,可以鉴定RBP和RNA之间的直接相互作用,确定 RBP 与miRNA、lncRNA 等非编码 RNA 的精确结合位点。
  上图展示了从免疫沉淀到PCR,该图显示CLIP-seq的一些重要步骤。例如:XL,UV交联;IP,免疫反应;磷酸酶,3’端去磷酸化;激酶,5’端磷酸化;RT,逆转录;L3,RNA或DNA 3’端适体连接;L5,5’端适体连接;PK提取,从硝基纤维素膜中提取蛋白酶K;Ppt/柱,乙醇沉淀或柱分离核酸;TBE、Tris-B酸盐-EDTA;SA、抗生物素蛋白。
2.不需要蛋白质纯化的澳门威斯尼人官网
  在不纯化RBP的情况下识别RBP的靶RNA的澳门威斯尼人官网是相对较新的,目前主要是对RNA进行两种不同化学修饰。第一种是TRIBE,感兴趣的蛋白质融合到ADAR酶,在ADAR使附近的腺嘌呤脱氨后,通过测序鉴定脱氨碱基。第二种是RNA标记法,poly(U)多聚酶与感兴趣的RBP融合后,添加poly(U)尾到结合的RNA。RNA 3’末端序列识别poly(U)尾;在特定亚细胞区过氧化物酶标记RBP,用于识别结合的RNA,这种澳门威斯尼人官网还没有被用来鉴定靶RNA。酶修饰RNA的澳门威斯尼人官网是可行的,以后会发现更多的酶修饰RNA。
  我们希望更多的技术在这一领域快速发展,多种差异的化学标记分离RBP对于RBP纯化组合调控和化学修饰组合研究,以此研究RBP-RNA相互作用的位置。


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