揭秘融合基因生成的circRNA
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-08-15
融合基因不仅编码融合蛋白,还能够产生circRNA参与肿瘤的发生和发展......

最新证据表明,融合基因不仅编码融合蛋白,还能够产生circRNA(通过线性RNA的反向剪接产生的一种共价键结合的RNA分子),参与肿瘤的发生和发展。本次主要介绍融合基因SLC34A2-ROS1,其编码融合蛋白以激活下游信号通路,如JAK/STAT、PI3K/Akt和RAS/Raf通路,并促进细胞增殖和存活。然而,SLC34A2-ROS 1基因在肿瘤发生过程中的潜在机制尚不清楚。
7月份,Ke Wu等人发表一篇 “Circular RNA F-circSR derived from SLC34A2-ROS1 fusion gene promotes cell migration in non-small cell lung cancer ”的SCI文章,由于SLC34A2-ROS 1基因是否产生circRNA仍未知,此文章研究人员不仅鉴定SLC34A2-ROS 1基因产生的circRNA F-cycSRs,还研究 F-cycSRs的潜在机制。
技术路线:

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结果:
一、在NSCLC细胞中鉴定circRNA F-circSR

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 SCLC细胞株HCC 78具有两种SLC34A2-ROS1融合基因,即两种长、短转录本(SLC34A2外显子4分别与ROS 1外显子32和34融合)(图A-B)。琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR产物的Sanger sequencing证实两种SLC34A2-ROS 1 mRNA,与GenBank中的EU236946.1和EU236947.1参考序列一致;检测出SLC34A2-ROS 1和F-SrcSRs融合位点(箭头指示方向)(图C-D),在HCC 78细胞中qPCR结果显示F-cyclcSR 1表达水平明显高于F-cyclcSR 2(附件)。
二、F-circSR促进NSCLC细胞迁移

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构建pCRE5-F-CircSR质粒,其图谱如上图所示(图A)。琼脂糖凝胶电泳和Sanger sequencing验证HEK293Tc-F-cycSR与HEK293Tc-Ctrl中 F-cycSR正确环化(图B)。由于H1299和A549细胞不表达SLC34A2-ROS1融合蛋白,选择这两种细胞系为构建过表达F-cycSR的细胞株,提取RNA并反转录后RT-PCR,琼脂糖凝胶电泳验证A549-F-cycSR和H1299-F-cycSR细胞稳定过表达F-cycSR(图C)。Transwell迁移实验表明,F-cycSR均显著促进细胞迁移(图D)。然而,MTT和colony formation实验表明,F-cycSR对细胞增殖影响不大。Wound healing assay 检测F-cycSR均显著促进细胞迁移(图E-F)。根据circRNA反向剪接连接处设计siRNAs,Transwell迁移实验表明,敲减F-cycSR显著降低A549-F-cycSR和H1299-F-cycSR细胞的迁移能力。由此可见,F-crcSR具有促进NSCLC细胞迁移的作用。
三、侧翼内含子的互补序列对F-CircSR生物发生起着重要的作用。

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  cycSR由多个外显子组成,circRNA生物发生依赖于顺式作用元件,其位于循环外显子的侧翼内含子,通常含有反向互补序列。生物信息学分析表明,cycSR的侧翼内含子具有反向互补序列(命名为CS1和CS2),由于cycSR1匹配序列较长,cycSR1中的CS1-CS2互补性比CircSR 2强(图A)。此文章研究人员分别将cycSR1与CircSR 2的CS1和CS2序列克隆到含分裂的外显子GFP报告系统,,除非插入的CS1和CS2序列,反向剪接产生circRNA,否则不表达GFP蛋白。此外,研究人员构建了剪接位点突变(从“AG”到“TT”,M1质粒)的质粒与下游互补序列CS2缺失的质粒(M2质粒)(图B)。GFP报告系统插入CIRCR正常的CS1和CS2序列可以驱动CircRNA形成来表达GFP蛋白,免疫荧光实验证明了cycSR1的CS1和CS2序列比CircSR 2的活性更强,生物信息学数据分析出CircSR 1中CS1和CS2的互补性更强,两者的结果是一致的。因此,配对较长的序列促进circRNA的形成,然而,破坏剪接位点或cycSR的互补序列,阻断了circRNA的形成,因此GFP不表达(图C)。Western blotting和流式细胞仪实验进一步证实了上述结论(图D-E)。因此,具有剪接位点的侧翼互补序列对cycSR的形成具有重要意义。通过激活ROS 1信号SLC34A2-ROS 1融合基因编码蛋白参与肿瘤的发生。上述结果表明, SLC34A2-ROS1可以产生circRNA发挥其致癌作用。此外,此文章也进行了生物信息学分析,发现circRNA具有miR-150-5p, miR-194-3p and miR-515- 5p 的结合位点,据报道这些miRNA调节细胞迁移能力。因此F-CircSR可以作为miRNA海绵发挥其功能。
结论:                                              
      此研究鉴定了在NSCLC细胞中SLC34A2-ROS1融合基因产生的两个新的CircSR1(命名为F-CIRCR1和F-CIRCR2),F-CIRCR1的表达高于F-CircSR2,侧翼互补序列和典型的剪接位点促进F-CIRCR1和F-CIRCR2的形成。此外,F-CircSR均促进细胞迁移。因此,此文献不仅扩大了对肿瘤生物学中染色体易位的认识,也提供了潜在的诊断和治疗生物标志物。

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