是敌是友?内源性 澳门威斯尼人手机游戏竟转运有功能的gRNA和Cas9蛋白
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-08-23
澳门威斯尼人手机游戏在许多生物过程中都发挥着重要作用,它究竟是否能直接转运细胞内的CRISPR-C系统至其他细胞......

2019年7月4日,来自北京大学医学部天然药物及仿生药物国家重点实验室的研究团队在杂志small(IF=10.856)上报道了内源性 澳门威斯尼人手机游戏能转运有功能的gRNA和Cas9蛋白(doi: 10.1002/smll.201902686)(Chen, Huang et al. 2019)。让我们一起来了解一下。

澳门威斯尼人手机游戏是广泛存在于各种体液中的由细胞分泌的纳米级囊泡,并携带有蛋白质、脂质和各类型核酸。它在许多生物过程中都发挥着重要作用。一些 澳门威斯尼人手机游戏中的miRNA、lncRNA等已被鉴定为肿瘤的诊断、预后标志物或治疗靶标。在另一方面,它也被作为一种药物转运载体被广泛研究。除了对传统药物的包装之外,对核酸以及CRISPR-Cas9相关的基因编辑治疗药物的包装也是研究热点。例如在Gulei D的报道中,通过在 澳门威斯尼人手机游戏供体细胞中表达TNF-α获得表面有TNF-α蛋白的 澳门威斯尼人手机游戏,然后在将CRISPR-Cas9系统转入 澳门威斯尼人手机游戏中特异性的识别肿瘤细胞(图1)(Gulei and Berindan-Neagoe 2019)。

                                         图1 制备含TNF-α的 澳门威斯尼人手机游戏转运CRISPR系统

而本文中,作者首先提出问题: 澳门威斯尼人手机游戏是否能直接转运细胞内的CRISPR-Cas9系统至其他细胞。作者以HBV稳定复制的细胞HepAD38为模型,共转染针对HBV的Cas9蛋白和一对sgRNA后,HBV的复制受到30%的抑制。而使用特异性抑制 澳门威斯尼人手机游戏释放的抑制剂GW4869处理后,CRISPR系统对HBV的抑制效果显著降低。这预示着 澳门威斯尼人手机游戏在这个过程中发挥着作用。作者便开始验证 澳门威斯尼人手机游戏中是否含有Cas9蛋白和gRNA。通过离心和CD63 pull-down的方法提取 澳门威斯尼人手机游戏后,通过western blot和PCR分别检测到了 澳门威斯尼人手机游戏中Cas9蛋白和gRNA的存在。这表明内源性 澳门威斯尼人手机游戏能转运CRISPR-Cas9系统(图2)。此外,作者也通过tCLN和TRIF的方法验证了 澳门威斯尼人手机游戏中gRNA的存在。此外通过对载体片段和未逆转录样品的PCR检测,也证明了 澳门威斯尼人手机游戏中转运的是gRNA而不是过表达载体。

                                          图2 CRISPR过表达细胞 澳门威斯尼人手机游戏中含有Cas9蛋白和gRNA

接下来,作者探究了 澳门威斯尼人手机游戏转运CRISPR-Cas9系统的机制。Cas9蛋白结合gRNA后发挥作用。那 澳门威斯尼人手机游戏转运Cas9蛋白和gRNA是否需要两者结合呢?作者首先通过免疫荧光检测到了CD63和Cas9蛋白的共定位。通过共转和单转Cas9和gRNA,作者发现单转Cas9或gRNA后,两者都能被 澳门威斯尼人手机游戏转运。这表明两者被 澳门威斯尼人手机游戏的转运并无相互依赖的关系(图3)。

                                          图3 Cas9蛋白和gRNA的转运无依赖关系

那么, 澳门威斯尼人手机游戏转运的CRISPR系统是否具有生物活性呢?作者将只表达针对HBV gRNA和Cas9的供体HuH 7细胞和只表达HBV的受体HuH 7细胞共培养;并以只表达Cas9的供体细胞为对照。PCR检测结果发现,受体细胞中含有被编辑的HBV DNA片段。如图4所示。此外,为了进一步验证转运CRISPR系统 澳门威斯尼人手机游戏的生物学功能,作者从常见得生物工程细胞株Vero和CHO细胞中提取了含Cas9和gRNA的 澳门威斯尼人手机游戏。该 澳门威斯尼人手机游戏能作用于HuH 7细胞。共培养后也与上述结果一致,可以编辑受体细胞。

                                       图4 澳门威斯尼人手机游戏中转运的CRISPR系统具有生物学活性

这一发现即对 澳门威斯尼人手机游戏药物转运研究提供助力,也对那些未发现的CRISPR/Cas系统脱靶效应和安全性做出警示。最后给出文章的模式图(图5)。

                                     图5 澳门威斯尼人手机游戏转运CRISPR系统并作用于受体细胞模式图
Chen, R., H. Huang, et al. (2019). "Friend or Foe? Evidence Indicates Endogenous Exosomes Can Deliver Functional gRNA and Cas9 Protein." Small: e1902686.
Gulei, D. and I. Berindan-Neagoe (2019). "Activation of Necroptosis by Engineered Self Tumor-Derived Exosomes Loaded with CRISPR/Cas9." Mol Ther Nucleic Acids 17: 448-451.

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