肺癌治疗的手段-澳门威斯尼人
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-09-06
凋亡诱导因子(澳门威斯尼人)不仅参与澳门威斯尼人凋亡,还在线粒体内通过调控呼吸链中复合物I的转录后发挥重要的功能......

凋亡诱导因子(澳门威斯尼人)不仅参与澳门威斯尼人凋亡,还在线粒体内发挥重要的功能,它通过线粒体呼吸链中复合物I的转录后调控,决定氧化磷酸化(OXPHOS)的速率。近些年,澳门威斯尼人被广泛研究。今天小编就带大家了解关于澳门威斯尼人调控氧化磷酸化支持肺癌的发展的文章澳门威斯尼人-regulated oxidative phosphorylation supports lung cancer development

在本研究中,作者使用KrasG12D驱动的小鼠肺癌模型,通过澳门威斯尼人敲减、线粒体呼吸评估、糖酵解、WT或线粒体锚定的澳门威斯尼人重新表达和和肺癌转录组数据分析证明了澳门威斯尼人调控线粒体呼吸和OXPHOS,从而促进肺癌的进展。
结果:

1)减少澳门威斯尼人缺乏KrasG12D小鼠的肺癌
为了确定澳门威斯尼人在肺癌中的作用,我们将澳门威斯尼人 fl/fl 小鼠与Lox-Stop-Lox-KrasG12D菌株杂交。Lox-Stop-Lox-KrasG12D小鼠在Cre缺失并诱导突变的KrasG12D等位基因后,逐步发展为非小澳门威斯尼人肺癌(NSCLCs),从上皮澳门威斯尼人增生到良性腺瘤和恶性腺癌。与对照组相比,KrasG12D驱动的肺癌模型中澳门威斯尼人的缺失显著延长了存活时间(图1a)。在所有时间点分析中,与对照相比,Aiffl / y KrasG12D小鼠肺中肿瘤区域的数量减少(图1 b, c)。这些结果表明,澳门威斯尼人基因失活可显著降低krasg12d驱动的肺癌发生。接下来我们评估了肿瘤的发生和肺癌的恶性进展。Ad5-CMV-Cre吸入4周后,微CT显示Aiffl/y KrasG12D小鼠肿瘤病灶明显减少,且在整个观察期间均观察到肿瘤病灶减少(图1d)。

2)澳门威斯尼人的缺失会损害OXPHOS并破坏线粒体结构
由于澳门威斯尼人影响肿瘤的发生和早期发展,我们从Aiffl/y KrasG12D和澳门威斯尼人+/y KrasG12D胎鼠中分离出原代肺澳门威斯尼人,随后用Ad5-CMV-Cre-eGFP感染培养澳门威斯尼人,激活KrasG12D表达,同时删除澳门威斯尼人(图2a)。正如之前研究中所预期的那样,澳门威斯尼人的缺失也导致线粒体复合物I蛋白的减少(图2a)。然后分析澳门威斯尼人突变原代肺澳门威斯尼人的耗氧量(OCR),以评估线粒体呼吸。Aiffl/y KrasG12D澳门威斯尼人在较低的基础水平上消耗氧气,产生更少的ATP,并且在对FCCP的响应中表现出有限的OCR增加,导致最大呼吸容量降低(图2 b,c)。
在体内Ad5-CMV-Cre感染6周后,我们从Aiffl/y KrasG12D和Aif+/y KrasG12D胎鼠中分离出原代转化的肺澳门威斯尼人。值得注意的是,小鼠感染的病毒滴度是正常浓度的5倍,以确保大多数肺澳门威斯尼人被感染(图2d)。与我们的短期培养相似,体内Ad5- CMV-Cre处理导致基础呼吸、ATP生成、最大呼吸和备用呼吸能力减少(图2e)。我们还对Ad5-CMV-Cre吸入16周后Aiffl/y KrasG12D和Aif+/y KrasG12D小鼠新分离肿瘤组织中的线粒体进行了表征。具有澳门威斯尼人活性的肿瘤澳门威斯尼人与缺乏澳门威斯尼人的肿瘤澳门威斯尼人线粒体数量无明显差异;然而,Aiffl/y KrasG12D肿瘤澳门威斯尼人线粒体肿胀,嵴结构明显减少,排列紊乱(图2f)。因此,澳门威斯尼人的缺失不仅会导致OXPHOS的普遍受损,还会导致线粒体形态异常。


3)澳门威斯尼人缺乏增强糖酵解和对葡萄糖缺乏的敏感性
在添加葡萄糖刺激糖酵解后,Aiffl/y KrasG12D肺澳门威斯尼人的基础澳门威斯尼人外酸化率高于Aif+/y KrasG12D对照澳门威斯尼人(图3a)。添加寡霉素后,通过OXPHOS抑制ATP产生,Aiffl/y KrasG12D澳门威斯尼人和Aif+/y KrasG12D澳门威斯尼人的糖酵解活性均增加,但Aif+/y KrasG12D澳门威斯尼人的糖酵解活性明显增加(图3 b)。在体外Ad5-mSPC-Cre处理的Aiffl/y KrasG12D肺澳门威斯尼人中,糖酵解也增加了(图3 c,d)。对照Aif+/y KrasG12D澳门威斯尼人不受2-DG 72 h孵育的影响,,而Aiffl/y KrasG12D澳门威斯尼人死亡率增加(图3e)。同样,葡萄糖缺乏对Aif+/y KrasG12D澳门威斯尼人无明显影响,但影响Aiffl/y KrasG12D澳门威斯尼人的生长(图3f)。最后,我们观察到在葡萄糖缺乏条件下培养的Aiffl/yKrasG12D肺澳门威斯尼人内ATP水平显著下降(图3g)。这些结果表明澳门威斯尼人的缺失导致OXPHOS缺乏症和澳门威斯尼人代谢向糖酵解的转变。Aiffl/y KrasG12D肺澳门威斯尼人中,OXPHOS对ATP合成的贡献较小,主要由糖酵解提供,而Aif+/y KrasG12D澳门威斯尼人中的ATP大部分由OXPHOS生成。


4)稳定的澳门威斯尼人缺失会损害KRAS WT和KRAS突变的肺癌澳门威斯尼人的克隆潜能和增殖
在KRAS突变的NSCLC A549澳门威斯尼人中,澳门威斯尼人的稳定下调抑制了CHCHD4的表达,并导致呼吸链蛋白如CIII-UQCRC2、cii - coxii和CI-NDUFB8的减少以及OXPHOS、ATP生成、克隆潜能和增殖的减少。另外,澳门威斯尼人敲除显著降低了H1437、H727、A427、H1650、H358以及A549澳门威斯尼人的克隆能力(图5)。

5)重新表达WT或线粒体锚定的澳门威斯尼人可恢复肺癌敏感性
Aiffl/y KrasG12D小鼠在吸入Ad5-CMV-Cre后存活的时间明显长于对照组小鼠。在敲除澳门威斯尼人的小鼠中重新表达WT 澳门威斯尼人后,存活率显著降低。而且线粒体锚定突变体澳门威斯尼人替代内源性澳门威斯尼人也恢复了Aiffl/y KrasG12D小鼠的癌症表型(图6c)。另外WT或突变澳门威斯尼人的重新表达导致肺肿瘤负荷增加(图6d,e)。接下来为了进一步研究澳门威斯尼人和OXPHOS在肿瘤澳门威斯尼人增殖和肿瘤干澳门威斯尼人样特性中的功能相关性,我们采用最近开发的3D肿瘤球体培养法,从Ad5-mSPC-Cre感染6周后的Aif+/y KrasG12D、Aiffl/y KrasG12D、Aiffl/y WT ki KrasG12D、Aiffl/y MT ki KrasG12D小鼠中分离纯化的原发肺澳门威斯尼人,进行澳门威斯尼人培养。在从每个基因型中植入相同数量的肿瘤澳门威斯尼人后,我们发现Aiffl/y KrasG12D小鼠与Aif+/y KrasG12D小鼠相比,来自Aiffl/y KrasG12D小鼠的肿瘤球体数量显著减少。WT和突变型澳门威斯尼人的重新表达几乎完全恢复了茎样性质,形成肿瘤球形,达到澳门威斯尼人 +/y KrasG12D对照水平(图6f,g)。接下来,我们通过BrdU标记来确定这些肿瘤球的增殖能力。再次,我们观察到Aiffl/y KrasG12D肿瘤球体中阳性澳门威斯尼人明显少于澳门威斯尼人 WT、澳门威斯尼人 WT敲入和澳门威斯尼人突变敲入肿瘤球体(图6h,i)。


6)WT或线粒体锚定澳门威斯尼人的修复可消除线粒体呼吸缺陷
将WT或线粒体锚定的澳门威斯尼人重新引入Aiffl/y KrasG12D肺澳门威斯尼人中,可将其呼吸能力提高到与澳门威斯尼人 +/y KrasG12D对照组相当的水平(图7a, b)。另外,与生物能量谱一致,澳门威斯尼人缺陷澳门威斯尼人所含PEP和NADH明显减少,但乳酸含量高得多(图7c),这表明澳门威斯尼人耗尽后OXPHOS确实受到抑制。另外,三羧酸循环的中间代谢物,包括柠檬酸、苹果酸和琥珀酸,在澳门威斯尼人缺乏的澳门威斯尼人中大量增加(图7c),这与KEGG富集分析一致(图7d)。



7)澳门威斯尼人
在人类肺肿瘤中经常过度表达,高澳门威斯尼人表达与低生存率有关
最后,我们通过分析已发表的数据集,探讨澳门威斯尼人在人类肺癌中的临床意义。肺癌和不同肺癌亚型的转录组研究表明,与正常组织相比,肺癌组织中澳门威斯尼人 mRNA水平显著上调(图8a)。为了在蛋白水平上验证这一发现,我们用免疫组织化学方法研究了澳门威斯尼人在人类肺癌样本中的表达。与之前的研究结果一致,我们观察到Kras突变和Kras WT肺癌患者的肿瘤组织中澳门威斯尼人表达均高于正常肺组织(图8b)。另外,我们发现,在三个不同的NSCLC群体中,不仅澳门威斯尼人,而且编码复合物I亚基或其组装因子的绝大多数基因在NSCLC组织中都比正常相邻肺组织明显过表达(图8c)。因此,当我们用Ad5-mSPC-Cre感染Aif+/y和Aif+/y KrasG12D小鼠的肺澳门威斯尼人时,在激活KrasG12D 8天后检测到澳门威斯尼人表达显著诱导;然而,在表达WT Kras的非转化性肺澳门威斯尼人中没有观察到这种效应(图8d)。此外,我们通过分析TCGA数据集中的RNAseq数据,评估了澳门威斯尼人表达与总生存率之间的相关性。发现无论KRAS突变情况如何,澳门威斯尼人高表达与预后不良呈负相关(图8e)。同样,免疫组化检测显示,NSCLCs表达低水平澳门威斯尼人蛋白的患者比澳门威斯尼人高肿瘤患者生存时间更长(图8f),这与澳门威斯尼人高表达与预后不良相关的结论一致。

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