LncRNA 澳门威斯尼人
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-11-07
长非编码RNA在多发性骨髓瘤(MM)中的生物学作用和治疗潜力是一个尚需研究的问题......

   长非编码RNA在多发性骨髓瘤(MM)中的生物学作用和治疗潜力是一个尚需研究的问题。针对NEAT1沉默的研究可以为抗MM的治疗方法提供新的思路。 近日,一篇名为“Long non-coding RNA NEAT1 targeting impairs the DNA repair machinery and triggers anti-tumor activity in multiple myeloma”的研究向我们展示了最新的研究结果。

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技术路线:

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1.NEAT1MM澳门威斯尼人中明显过表达

   与正常骨髓浆澳门威斯尼人相比,NEAT1MMPCL患者中过表达。将NEAT1表达分析扩展到具有代表性的广泛的人类血液肿瘤,包括MM(n=20),淋巴瘤(n=8)和白血病(n=7)澳门威斯尼人系。按照之前描述的基于定量实时PCR的方法,发现在人骨髓瘤澳门威斯尼人系(HMCL)中NEAT1的全局表达比在其他肿瘤澳门威斯尼人系中高出约六倍(1)。

说明: 1

2.LncRNA NEAT1调节MM澳门威斯尼人的增殖和存活

   据报道,g#N1可以使NEAT1沉默。研究者使用亚澳门威斯尼人毒性浓度(5µM)评估g#N1_E传递的时间依赖性效应。如2a所示,NCI-H929AMO-1澳门威斯尼人系中g#N1_E传递显著下调了两种NEAT1亚型的表达,导致lncRNAs沉默4天后澳门威斯尼人活力降低(2bc)。基于BMMM肿瘤澳门威斯尼人的支持作用,接下来在BM环境下测试了NEAT1的沉默。如2d所示,g#N1_E处理也抑制了NCI-H929AMO-1澳门威斯尼人系与HS-5澳门威斯尼人共培养时的生长和生存。这些数据表明,NEAT1靶向可能能够克服BM环境对MM澳门威斯尼人的增殖和促进生存的影响。体内实验证实,通过使用从g#N1_E的体外活性衍生的治疗计划,并基于为类似的LNA ASO设计的方案,可以发现g#N1_E减少了AMO-1异种移植物的生长(2e)。最后,评估裸露的g#N1_E对来自MM患者的CD138+澳门威斯尼人的抗MM作用。在g#N1_E暴露6天后,NEAT1下调导致明显的澳门威斯尼人死亡,证实了对HMCL的影响(2f)。

说明: 2

3.NEAT1基因敲除影响澳门威斯尼人周期,促进澳门威斯尼人凋亡

   对NEAT1耗尽的MM澳门威斯尼人进行澳门威斯尼人周期分析。如3a所示,在NEAT1敲除6天后,测量到澳门威斯尼人周期相位分布的强烈调整。此外,澳门威斯尼人荧光分析也显示在两种澳门威斯尼人系中S期减少,这进一步证实了BrdU摄取减少(3b)。在NEAT1沉默5天后,通过流式澳门威斯尼人术、western blot分析和caspase-3-7活性测定分析NEAT1对澳门威斯尼人凋亡的影响。流式澳门威斯尼人术分析显示,与相对阴性对照相比,AMO-1NCI-H929,沉默澳门威斯尼人的凋亡率显著增加(3c)。WB法测定caspase 37裂解,结果显示在NEAT1沉默后PARP裂解(3d)。在体内也观察到了减少的增殖和凋亡特征,NEAT1KD既增加了caspase-3,又减少了AMO-1异种移植澳门威斯尼人的Ki67染色(3e)。NEAT1耗尽也在MM患者衍生的肿瘤中触发caspase37切裂解(3f)。

说明: 3

4. MM澳门威斯尼人中NEAT1靶点的识别

   为了确定MMNEAT1下游相关通路,对NEAT1耗竭后NCI-H929AMO-1的基因表达谱分析。在用g#N1_E LNA-gapmeR处理96小时的不同HMCL和其他血液肿瘤中,通过qRT-PCR验证了五个基因的调节。只有表现出生物学反应的澳门威斯尼人系(就降低的活性而言)g#N1_E LNA-gapmeR给药后也表现出这些基因的下调(4a)。对从AMO-1小鼠移植瘤澳门威斯尼人中提取的RNA进行的qRT-PCR分析证实,在g#N1_E LNA-gapmeR给药后,这些基因下调,用g#N1_E LNAgapmeR处理48小时的原代肿瘤澳门威斯尼人分析也证实了这些发现(4b)。。
   聚焦于这些途径,可以发现RAD51蛋白随着激酶蛋白CHK1Chk2的磷酸化部分的降低而减少,这些蛋白都参与了DNA损伤检查点;发现RPA32BRCA1的活性量下调,这两种蛋白分别是DNAdamage传感器蛋白和DNA修复机制的必要效应器(5a
为了评估NEAT1沉默引起的DNA修复过程的假设损伤是否与DNA损伤增加相关,评估当DNA损伤发生时被磷酸化的H2A.X蛋白的表达和模式分布。如5bWB所示,NEAT1下调导致遗传毒性应激增加。接下来研究了Oaparib(一种PARP抑制剂,在HR缺乏的肿瘤中诱导合成致死性)在NEAT1耗竭澳门威斯尼人中的作用。在NEAT1存在或不存在的情况下增加了这种药物的浓度,处理了AMO-1NCI-H929,然后评估每个样品中的澳门威斯尼人存活,g#N1_E LNA-gapmeRolaparib的组合在几乎所有的测试组合中都产生了协同效应(5c)。

说明: 4

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5.NEAT1沉默使肿瘤澳门威斯尼人对抗MM药物敏感

   为了评估NEAT1MM澳门威斯尼人耐药机制中的作用,评估与MM治疗的最常用药物,即BortezomibCarfilzomibMelphalan的协同效应的发生情况。为此,用存在或不存在NEAT1 gapmeR的不同浓度的每种药物处理NCI-H929AMO-1澳门威斯尼人系,然后评估每个样品中的活澳门威斯尼人。结果,g#N1_E LNA-gapmeRcarfilzomibmelphalanbortezomib的组合产生了协同效应(6a)。


   为了深入了解NEAT1抑制与卡非罗米和硼替佐米联合使用的协同作用,将蛋白酶体抑制剂通过靶向ssDNA/RPA32信号中间体来破坏同源DNA重组。基于g#N1_E LNA-gapmeR诱导的RPA32活性量的下调(5a),评估了结合蛋白酶体抑制剂和NEAT1反义寡核苷酸对pRPA32的影响。如6b,与各单独处理相比,卡非唑米和硼替佐米联合NEAT1抑制进一步降低了pRPA32NCI-H929AMO-1中的比例。


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