circTRIM33-12作为MicroRNA-澳门威斯尼人
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-11-22
肝细胞癌(HCC)是全球排名第三的死亡相关癌症,HCC的临床特征是其侵袭性,预后不良和治疗机会有限......

   肝细胞癌(HCC)是全球排名第三的死亡相关癌症,HCC的临床特征是其侵袭性,预后不良和治疗机会有限。近期, 复旦大学中山医院研究团队在Molecular Cancer期刊上发表了一题名为:Circular RNA circTRIM33–12 acts as the sponge of MicroRNA-191 to suppress hepatocellular carcinoma progression的文章。该文章主要讲述了circTRIM33-12可以作为致癌miR-191的吸附海绵起作用以上调TET1澳门威斯尼人并因此抑制HCC进展。


一、在HCC中调节TRIM33衍生的circTRIM33-12
   TRIM33是一种肿瘤抑制基因,TRIM33HCC中的下调是由TRIM33启动子中CpG岛的高度甲基化引起的,表明源自TRIM33circRNA澳门威斯尼人可能在HCC细胞中下调。作者通过qRT-PCR分析了四对HCC组织样品中18TRIM33来源的circRNA。在四个HCC肿瘤组织中的circTRIM33-12hsa_circRNA8662-12)澳门威斯尼人显著降低。circTRIM33-12TRIM33外显子12-18组装而成。为了进一步研究circTRIM33-12澳门威斯尼人对HCC患者的预后意义,对200HCC及癌旁组织进行qRT-PCR验证circTRIM33-12的澳门威斯尼人。与癌旁组织相比,116例(58%HCC组织中circTRIM33-12澳门威斯尼人显著降低。以circTRIM33-12的澳门威斯尼人中间值为节点,对HCC组织进行高澳门威斯尼人与低澳门威斯尼人划分。分析circTRIM33-12澳门威斯尼人与HCC患者临床病理特征之间的关系,与高澳门威斯尼人的患者相比,cirTRIM33-12 澳门威斯尼人量低的 HCC患者肿瘤大小较大(P  = 0.022),肿瘤数量多(P  = 0.028),侵袭强(P  = 0.007)。对这200例患者进行术后生存和术后复发进行分析,发现cirTRIM33-12低澳门威斯尼人患者生存期显著高于高澳门威斯尼人患者,手术复发显著低于高澳门威斯尼人患者。


二、circTRIM33-12抑制HCC细胞的增殖和侵袭
   从7HCC细胞系中筛选circTRIM33-12低澳门威斯尼人细胞系,选取SMMC-7721HCCLM3进行后续试验。与对照组相比,过澳门威斯尼人circTRIM33-12SMMC-7721HCCLM3细胞的生长和转移显着受到抑制。敲低circTRIM33-12促进了高澳门威斯尼人细胞系Huh 7MHCC97L细胞的生长和转移。为了进一步探索circTRIM33-12在体内的作用,将过澳门威斯尼人的SMMC-7721和对照组种植到小鼠肝内。过澳门威斯尼人的肿瘤体积和转移能力显著低于对照组。


三、circTRIM33-12可作为miR-191的吸附海绵
   Huh 7细胞中用针对AGO2的抗体进行RIP实验,circTRIM33-12AGO2抗体有明显富集作用,表明可作为AGO2miRNA的结合平台。使用数据库预测到11个可能与circTRIM33-12结合的潜在miRNA。这11miRNA中有三种是癌基因,分别是miR-23a-3pmiR-191miR-224-5p。为了进一步研究circTRIM33-12与这三种miRNA结合,构建含有荧光素酶基因的circTRIM33-12澳门威斯尼人质粒载体,并将质粒载体转染到Huh 7细胞中。观察到转染后3miRNA减少,特别的miR-191显著减少。使用生物素标记的miR-191进行pulldown实验,与NC组相比miR-191circTRIM33-12有明显富集作用。对miR-191敲低过澳门威斯尼人,发现circTRIM33-12澳门威斯尼人没有变化;circTRIM33-12过澳门威斯尼人后,miR-191澳门威斯尼人也没有变化。这说明circTRIM33-12miR-191可能不会相互降解。这些实验表明,circTRIM33-12可以作为miR-191的吸附海绵起作用。


四、circTRIM33-12通过海绵miR-191上调TET1澳门威斯尼人
   一些研究显示,TET1TIMP3SATB1DIECR1miR-191影响。但是在炎症细胞系中上调或敲低miR-191对它们的mRNA和蛋白澳门威斯尼人水平没有改变,但是对TET1蛋白澳门威斯尼人有影响。使用荧光素酶报告法检测TET1 mRNA3'UTR是否是HCC细胞中miR-191的靶标,结果表明miR-191TET1 mRNAHCC细胞中的直接相互作用。为了验证circTRIM33-12TET1澳门威斯尼人的影响,过澳门威斯尼人circTRIM33-12,检测TET1 mRNA和蛋白质澳门威斯尼人水平。结果表明,circTRIM33-12的过澳门威斯尼人显著增加TET1蛋白水平而不是mRNA水平。circTRIM33-12的敲低显著降低TET1蛋白水平而不是mRNA水平。荧光素酶活性测定表明敲低circTRIM33-12后,TET1活性下降;circTRIM33-12miR-191一起敲低后,TET1活性无影响。circTRIM33-12过澳门威斯尼人后,TET1活性增强;circTRIM33-12过澳门威斯尼人同时miR-191敲低后,TET1活性无影响。在200HCC患者组织使用qRT-PCRIHC验证TET1的澳门威斯尼人。发现在HCC患者中circTRIM33-12TET1之间呈正相关关系。


五、circTRIM33-12TET1负责调节5hmC的澳门威斯尼人
   在circTRIM33-12TET1过澳门威斯尼人的SMMC-7721HCCLM3细胞中比较5mC5hmC水平,发现在circTRIM33-12-TET1-过澳门威斯尼人细胞中5hmC的水平显着增加;相反,,在circTRIM33-12TET1敲低的Huh 7MHCC97L细胞中5hmC的水平显着降低。并且过澳门威斯尼人TET1的细胞细胞增殖和侵袭迁移能力明显减弱。结果与第二部分完全结果一致,。这些数据证明了circTRIM33-12作为miR-191的吸附海绵抑制HCC进展,通过circTRIM33-12 / miR-191 / TET1轴抑制miR-191致癌作用。


六、TET1负调节癌基因澳门威斯尼人并与免疫逃避有关
   接下来试图研究TET1敲低是否转录抑制HCC细胞中的肿瘤抑制基因澳门威斯尼人。RNA-seq结果显示,TET1敲低下调了几种参与肿瘤进展的肿瘤抑制基因,如WWC家族成员3WWC3),肿瘤蛋白p53诱导核蛋白1TP53INP1),UL16结合蛋白1ULBP1)和赖氨酸脱甲基酶7AJHDM1D)。为了研究circTRIM33-12是否通过miR-191 / TET1轴发挥其生物学功能,在circTRIM33-12TET1敲低或过澳门威斯尼人的HCC细胞中检测WWC3 TP53INP1ULBP1JHDM1D的澳门威斯尼人。敲低circTRIM33-12TET1显著减少了WWC3 TP53INP1ULBP1JHDM1D的澳门威斯尼人。过澳门威斯尼人circTRIM33-12TET1增加WWC3 TP53INP1ULBP1JHDM1D mRNA和蛋白澳门威斯尼人水平。使用荧光素酶报告基因测定验证WWC3 TP53INP1ULBP1JHDM1D mRNA3'UTR是否是miR-191的靶标。结果发现荧光素酶活性无明显变化,这就说明WWC3 TP53INP1ULBP1JHDM1D mRNA3'UTR不是miR-191的靶标。为了进一步探讨circTRIM33-12与免疫逃避之间的关系,检测200HCC癌和癌旁组织中NKG2D的澳门威斯尼人。在HCC组织中NKG2D阳性细胞的数目与癌旁组织相比较显著降低。散点图分析揭示了在HCC组织中circTRIM33-12澳门威斯尼人和NKG2D阳性细胞数之间呈正相关性。这些结果表明,circTRIM33-12可通过海绵吸附作用miR-191保护TET1而发挥其抗肿瘤作用。


七、miR-191的敲低改变了circTRIM33-12的敲低并诱导了HCC细胞的进展
   接下来探讨了miR-191的敲低是否影响了cirTRIM33-12敲低的HCC细胞增殖、迁移和侵袭。在敲低cirTRIM33-12的细胞系中,敲低miR-191 TET1蛋白澳门威斯尼人升高,mRNA澳门威斯尼人无变化。在敲低cirTRIM33-12的细胞系中,miR-191的敲低显著降低了HCC细胞增殖、迁移和侵袭。

结论:
   在HCC组织中circTRIM33-12澳门威斯尼人显著降低,并且低水平的circTRIM33-12澳门威斯尼人与HCC患者的不良预后相关。circTRIM33-12通过吸附miR-191并上调TET1澳门威斯尼人抑制HCC增殖、转移和免疫逃避,表明其在HCC进展中的肿瘤抑制作用。为HCC靶向治疗提供了新的靶点。

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