CircFOXO3促进胶质母细胞瘤的进展
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-12-05
环状RNA是一种新发现的内源性非编码RNA,被认为可以介导多种类型肿瘤的进展......

   环状RNA是一种新发现的内源性非编码RNA,被认为可以介导多种类型肿瘤的进展。越来越多的证据表明环状RNA在癌症中异常澳门威斯尼人官网,并参与肿瘤的发展,包括增殖、存活和运动。另外环状RNA主要作为miRNA海绵,它们通过竞争性结合miRNA反应元件相互沟通和调节,进一步调节miRNA靶向基因澳门威斯尼人官网,结合蛋白质,编码蛋白质和促进核易位。这些发现表明,异位澳门威斯尼人官网的环状RNA在肿瘤发生和癌症进展中起重要作用。虽然已经对环状RNA在GBM中的作用进行了初步研究,但对环状rna在GBM中的临床意义和作用机制仍未明确。因此,小编通过以下这篇文章,让大家对circFOXO3在胶质母细胞瘤中的作用机制有深刻的了解。

   本研究中,首先,我们通过qRT-PCR分析了GBM和非癌组织中circFOXO3的变化。接下来,我们使用功能损失和功能获得的方法来评估circFOXO3对GBM细胞增殖和侵袭的影响。最后,我们进行了荧光原位杂交、RNA下拉、双荧光素酶报告基因和RNA免疫沉淀分析,以确认环状FOXO3和miR-138-5p/miR-432-5p在GBM中的相互作用。并用动物模型验证了体外实验结果。
结果:
1.人GBM组织中CircFOXO3高澳门威斯尼人官网
   CircFOXO3包含一个外显子,该外显子通过反向剪接最终产生一个1435个核苷酸的转录本(图1A,B)。使用扩增引物在GBM细胞中扩增出连接位点上游和下游约100 bp的CircFOXO3 cDNA,并通过Sanger测序进行分析。结果证实了circFOXO3连接(图1C)。扩增引物在有或无RNase R处理的cDNA中检测到环状RNA,证明circRNA是真正的环状(图1D)。
   为了研究circFOXO3在GBM中的澳门威斯尼人官网是否变化,我们检测了48例胶质瘤和10例正常对照组中circFOXO3的澳门威斯尼人官网。如图1E所示,高级别胶质瘤(HGG)的circFOXO3明显高于低级别胶质瘤(LGG)。总之,这些数据表明,circFOXO3澳门威斯尼人官网的增加可能与GBM进展密切相关。接着我们测定了4个GBM细胞(U87-MG、U251-MG、A172和T98G)和人类正常胶质细胞(HEBs)中circFOXO3的澳门威斯尼人官网水平。与HEBs相比,GBM细胞中circFOXO3明显上调,U251-MG和U87-MG高澳门威斯尼人官网,A172和T98G低澳门威斯尼人官网。因此,U251-MG和U87-MG用于circFOXO3 KD,A172和T98G用于circFOXO3 OE(图1F)。另外,我们有效地敲除了U87-MG和U251-MG细胞中的circFOXO3(图1G和1I)。我们还成功构建了circFOXO3澳门威斯尼人官网慢病毒和过澳门威斯尼人官网circFOXO3在A172和T98G中的澳门威斯尼人官网(图1H,I)。这为接下来探索circFOXO3在GBM细胞中的作用奠定了基础。

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2.CircFOXO3在体外促进GBM的发生和侵袭
   为了验证circFOXO3的功能,我们进行了细胞实验。CCK-8实验表明,circFOXO3 KD可以显著抑制U87-MG和U251-MG细胞的增殖(图2A,B)。此外,集落形成实验表明,circFOXO3 KD可以减少集落数量(图2C,E)和体积(图2F)。然后,我们使用transwell和伤口愈合试验来分析circFOXO3对GBM细胞侵袭的影响。Transwell实验表明,circFOXO3 KD细胞的侵袭力明显减弱(图2 G-I)。此外,伤口愈合实验表明,U87-MG和U251-MG的伤口闭合速度比对照组慢(图2J-L)。总的来说,这些发现为circFOXO3 KD在体外抑制GBM细胞的增殖和侵袭提供了证据,circFOXO3水平的升高对促进GBM细胞的肿瘤发生和侵袭具有重要作用。

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3.CircFOXO3GBM细胞中充当MiR-138-5pMiR-432-5p的海绵
   环状RNA主要位于细胞质中,通常作为miRNA海绵来调控澳门威斯尼人官网和活性。因此,我们首先搜索了circRNADb数据库,发现circFOXO3没有预测到任何蛋白特征。第二,FISH分析显示circFOXO3含量丰富,位于胞质中(图3A)。基于上述发现,我们探讨了circFOXO3是否与miRNAs结合。
   我们在不同的公共数据库(RegRNAstarBasemiRDBCircInteractome)和以前的报告中筛选并分析了2miRNA miR-138-5pmiR-432-5p)。这些miRNA在胶质瘤中澳门威斯尼人官网下调,且与circFOXO3相关的特异性miRNA有多个结合位点。在寻找与circFOXO3结合的miRNAs时,我们发现在circFOXO3miR-138-5p/miR- 432-5p的结合位点(图3B)。随后,我们研究了circFOXO3GBM细胞中miR-138-5p/ miR-432-5p的相关性。MiR-138-5pmiR-432-5p澳门威斯尼人官网在circFOXO3 KD后上调,在circFOXO3 OE后下调(图3CD)。此外,过澳门威斯尼人官网miR-138-5p/miR-432-5p后,circFOXO3水平明显降低,抑制miR-138-5p/miR-432-5p后,circFOXO3水平升高(图3EF)。
   为了验证circFOXO3miR-138-5p/miR-432-5p之间的直接结合,我们进行了生物素偶联miRNA捕获和荧光素酶活性测定。生物素标记的miR-138-5p/miR-432-5p及其突变模拟物被设计用于拉低过澳门威斯尼人官网circFOXO3T98G细胞中的circFOXO3。与突变体相比,我们发现野生型miR-138-5p/miR-432-5pcircFOXO3明显富集(图3G)。此外,HEK293T细胞共转染miR-138-5p/miR-432-5p模拟物和荧光素酶报告基因。与对照组相比,miR- 138-5p/miR-432-5p转染降低了荧光素酶报告基因的活性。然后,我们对miR-138-5p/miR-432-5p的预测结合位点进行突变,发现miR-138-5p/miR-432-5p模拟物和对照组的荧光素酶报告基因活性没有差异(图3H)。先前研究表明,环状RNAmiRNA的结合是由AGO2介导的。因此,我们在U87-MG中进行了anti-AGO2 RIP实验,结果显示circFOXO3miR-138-5p/miR-432-5pAGO2中富集(图3I)。这些结果表明circFOXO3可以作为miR-138-5p/miR-432-5p的海绵。


4.MiR-138-5p/miR-432-5p通过靶向GBM细胞中的NFAT5而下调并作为抑癌基因
   考虑到circFOXO3miR-138-5p/miR-432-5p之间的相互作用,我们接下来评估了miR-138-5p/miR-432-5pGBM中的澳门威斯尼人官网和功能。如图4AB所示,HGGmiR-138-5p/miR-432-5p明显低于正常对照组。此外,CCK-8实验显示,miR-138-5p/miR-432-5p澳门威斯尼人官网降低可显著提高细胞活力(图4CD)。此外,transwell实验表明,miR-138-5p/miR-432-5p抑制剂转染细胞的侵袭能力明显高于nc转染细胞(图4E)。
   根据既往报道,某些GBM致癌基因是miR-138-5p/miR-432-5p的靶标。因此,使用mirDIP数据库在miR-138-5p/miR-432-5p靶标中选择了14个致癌基因。在这些致癌基因中,有3个(CDK6NFAT5SP1)与肿瘤的进展密切相关。因此,我们改变了miR-138-5p/ miR-432-5p的澳门威斯尼人官网,并检测了各自靶细胞的水平(图4FG)。Western blot分析显示过澳门威斯尼人官网miR-138-5pmiR-432-5p的细胞中NFAT5澳门威斯尼人官网下调,而转染miR-138-5pmiR-432-5p抑制剂的细胞中NFAT5澳门威斯尼人官网上调(图4 G)。此外,GBMNFAT5 mRNA和蛋白水平较高(图4HI)。NFAT5被证明具有miR-138-5p/miR-432-5p的结合位点(图4J)。然后,克隆NFAT5的野生型和突变体3个未翻译区域序列,分别构建报告质粒和突变体载体。共转染miR-138-5p/miR-432-5p模拟物和报告质粒后,荧光素酶活性显著降低。相反,miR-138-5p/miR- 432-5p模拟物和突变载体共转染对荧光素酶活性没有明显影响(图4K)。因此,本研究结果证实NFAT5miR-138-5p/ miR-432-5p的直接靶点。

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5.CircFOXO3可以调节MiR-138-5pMiR- 432-5p靶点
   我们测量了这些靶点在circFOXO3 OEKD后的澳门威斯尼人官网。结果表明,当circFOXO3过澳门威斯尼人官网时,NFAT5的上调最为显著(图5AB)。鉴于NFAT5circFOXO3共享MREs,我们通过相关性分析和拯救实验实验,探讨circFOXO3是否通过海绵miR-138-5p/ miR-432-5p调控NFAT5澳门威斯尼人官网,从而发挥其致癌作用。相关分析显示,circFOXO3NFAT5呈中度正相关(图5C)。此外,circFOXO3miR-138-5pmiR-432-5p呈中度负相关(图5DE)。
此外,通过共转染circFOXO3 KDmiR-138-5p/miR-432-5p抑制剂U87-MG来进行拯救实验。qRT-PCRwestern blot检测显示,与circFOXO3 KD组相比,NFAT5 mRNA和蛋白水平在circFOXO3 KDmiR-138-5p/miR- 432-5p抑制剂共转染的U87-MG细胞中部分升高(图5FG)。与circFOXO3 KD组相比,miR- 138-5p/miR-432-5p抑制剂共转染的U87-MG细胞的增殖能力增强(图5H)。这些结果表明,抑制miR-138-5p/miR-432-5p可以部分恢复circFOXO3 KD诱导的增殖抑制。同样,circFOXO3 KD也可以部分减弱miR-138-5p/miR-432-5p介导的U87-MG细胞的侵袭的下调(图5I)。

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6.CircFOXO3的抑制抑制了异种移植体在体内的生长
   为了确定circFOXO3在体内对GBM进展的影响,我们将circFOXO3 KDcircFOXO3 NC细胞注入麻醉裸小鼠体纹状体。植入后,少数动物开始出现发病迹象,通过MRI对小鼠进行评估以确定颅内肿瘤形成。结果表明,CircFOXO3抑制显著降低了肿瘤的生长和侵袭。引人注目的是,植入circFOXO3 KD细胞的小鼠中位生存期为56.5天,而对照组100%37天内死亡(图6A-D)。在circFOXO3 KD组中,NFAT5的澳门威斯尼人官网持续下降(图6EF)。总之,这些结果表明,circFOXO3在体内对GBM的进展至关重要。

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总结:

   我们首次证明circFOXO3GBM组织中过澳门威斯尼人官网,并作为miR- 138-5p/miR-432-5p海绵通过ceRNA机制调节NFAT5的澳门威斯尼人官网,从而在体内外促进肿瘤的发生。我们证明circFOXO3GBM中一个新潜在的治疗靶点。我们的发现强调了circRNAmiRNA相互作用在肿瘤发生中的重要性。

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