缺氧胶质瘤澳门威斯尼人分泌的外泌体miR-澳门威斯尼人
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-12-06
最近的证据表明,miRNAs可以被释放到澳门威斯尼人外微环境中,并通过外泌体介导澳门威斯尼人与澳门威斯尼人之间的通讯......

    最近的证据表明,miRNAs可以被释放到澳门威斯尼人外微环境中,并通过外泌体介导澳门威斯尼人与澳门威斯尼人之间的通讯。今天小编带大家了解近期发表于Molecular therapy上的一篇关于缺氧胶质瘤澳门威斯尼人分泌的外泌体miR-301a通过靶向TCEAL7激活Wnt/β-catenin信号并促进放疗抵抗的文章。本研究的目的是鉴定参与胶质母澳门威斯尼人瘤(GBM)抗放疗的外泌体miR-301a(exo-miR-301a),并揭示其可能的机制。


技术路线:



结果:
1.exo-miR-301a由缺氧GBM澳门威斯尼人特异性表达和分泌
   根据我们之前的观察,miR-301a在胶质瘤组织中显著上调。在此,我们检测exo-miR-301a在缺氧人GBM中的功能。HIF-1α表达作为缺氧生物标志物,与miR-301a在胶质瘤患者中的表达进行比较。HIF-1α水平高的患者miR-301a表达水平较高(图1A),血清exo-miR-301a的百分比根据HIF-1α免疫组化评分分布(图1B)。ELISA结果显示,GBM澳门威斯尼人对缺氧的反应是通过增加澳门威斯尼人核中HIF-1α的水平(图1C)。从正常或缺氧条件下暴露的GBM澳门威斯尼人中检测含有CD9、CD63、CD81和HSP70的外泌体标记物。如图1D所示,缺氧澳门威斯尼人中所有外泌体标记物的水平均高于常氧澳门威斯尼人。低氧条件也显著增加了外泌体中存在的囊泡数量,这可以通过纳米颗粒跟踪分析检测到(图1E)。为了探讨miR-301a表达增加与HIF-1α之间的关系,我们观察了miR-301a和exo-miR-301a在HIF-1α不同状态下的水平。缺氧诱导HIF-1α, siRNA干扰后降低(图1F)。缺氧显著增加了miR-301a和exo-miR-301a的表达;同时,HIF-1α的下调显著降低了miR-301a和exo-miR-301a的表达(图1G和1H)。综上所述,我们证明exo-miR-301a是由缺氧GBM澳门威斯尼人特异性分泌的,与HIF-1α状态有关。


2.来自缺氧胶质瘤澳门威斯尼人的exo-miR-301a直接作用于常氧胶质瘤澳门威斯尼人中的TCEAL7

   为了探讨miR-301a在TCEAL7调控中的作用,我们检测了exo-miR-301a与TCEAL7蛋白在胶质瘤患者中的关系。TCEAL7水平与miR-301a的表达水平呈负相关(图2A)。为了证实miR-301a与TCEAL7的直接结合,设计荧光素酶报告实验,利用含有野生型(WT)和突变体(MT)的荧光素酶报告质粒TCEAL7 3’UTRs与miR-301a结合位点进行。TCEAL7 3‘UTR包含miR-301a的两个高度保守的靶位点,第一个靶位点被证明是结合位点(图2B)。如图2C所示,与TCEAL7- 3’UTR突变组相比,miR-301a在常氧和缺氧条件下均显著干扰了转染luc -TCEAL7-UTR的澳门威斯尼人的荧光素酶活性。与荧光素酶报告实验结果一致,在常氧和缺氧条件下,转染As-miR-301a导致TCEAL7表达显著下降(图2D)。此外,我们还检测了正常培养的GBM澳门威斯尼人中TCEAL7的表达。与对照组和常氧外泌体组相比,缺氧外泌体处理降低了荧光素酶活性(图2E)。此外,与正常组和对照组相比,缺氧外泌体处理显著改变了TCEAL7蛋白水平(图2F)。通过转染As-miR-301a,可以阻止缺氧衍生的外泌体对TCEAL7下调的影响(图2G)。

 

3.TCEAL7在胶质瘤恶性肿瘤中经常下调

   在相似的组织中检测到TCEAL7蛋白水平,并随着恶性肿瘤程度的增加而下调(图3A)。采用qPCR技术分析TCEAL7在胶质瘤及正常脑组织中的表达。如图3B所示,TCEAL7在胶质瘤组织中的表达低于正常组织,且随着病理分级的升高而降低。生存分析显示TCEAL7高表达患者的生存率明显高于TCEAL7低表达患者(图3 C)。与对照组相比,在TCEAL7载体组中TCEAL7蛋白水平显著升高(图3D)。 MTT结果显示,经TCEAL7处理的澳门威斯尼人存活率低于阴性对照组澳门威斯尼人(图3E)。克隆实验表明,转染TCEAL7载体的澳门威斯尼人在软琼脂上形成的菌落明显少于对照组(图3F)。此外,上调TCEAL7表达可显著降低GBM澳门威斯尼人侵袭能力(图3G)。采用Annexin V/propidium iodide(PI)双染色,TCEAL7载体中凋亡澳门威斯尼人比例显著增加(图3H)。
接下来,我们建立了皮下肿瘤U87澳门威斯尼人株,如图3I所示,两组在肿瘤大小的前9天无明显差异;然而,从第10天开始,与对照组相比,TCEAL7载体组的异种移植瘤的大小明显减小。


4.TCEAL7通
过与β-catenin结合负调控Wnt/β-catenin转录通路,而不抑制β-catenin的稳定性
   为了研究TCEAL7与Wnt/ β-catenin信号通路之间的相互作用,我们首先研究了TCEAL7过表达对H4澳门威斯尼人中β-catenin/T澳门威斯尼人因子(TCF)转录活性的影响。β-catenin的加入显著增强了TOP FLASH活性。然而,TCEAL7的过表达抑制了β-catenin刺激的TOP FLASH报告基因的活性(图4A)。另外,通过TOP/FOP reporter构建的高级别胶质瘤澳门威斯尼人U87和LN229中检测到,TCEAL7的高表达显著抑制了Wnt/β-catenin活性(图4B)。然后我们检测TCEAL7是否调控wnt靶向基因的表达。结果表明,在TCEAL7过表达澳门威斯尼人中,wnt靶向基因的表达水平显著降低(图4C)。但过表达TCEAL7并没有抑制β-catenin蛋白水平(图4D)。为了进一步研究TCEAL7过表达对β-catenin稳定性的影响,我们进行了环己酰亚胺追踪实验。结果显示过表达TCEAL7的澳门威斯尼人与对照澳门威斯尼人相比,β-catenin没有显著变化(图4E)。为了深入了解TCEAL7抑制表面TCF活性的机制,我们研究了TCEAL7是否与β-catenin发生物理作用。结果表明纯化后的TCEAL7与GST-β-catenin共沉淀,但不单独与GST共沉淀(图4F)。此外,HA-β-catenin与FLAG-TCEAL7共沉淀(图4G)。内源性β-catenin与内源性TCEAL7共沉淀,在U87和LN229澳门威斯尼人中形成复合物(图4H)。最后,当我们增加TCEAL7在胶质瘤澳门威斯尼人中的表达时,我们检测了β-catenin的核易位。免疫荧光图4I显示,与空白对照相比,TCEAL7过表达阻断了β-catenin从澳门威斯尼人质向澳门威斯尼人核的易位。


5.从缺氧胶质瘤澳门威斯尼人中提取的exo-miR-301a转移到正常胶质瘤澳门威斯尼人中,通过靶向TCEAL7增加Wnt/ β-catenin信号的活性
   为了证实缺氧胶质瘤澳门威斯尼人分泌的miR-301a可以通过外泌体转移到正常澳门威斯尼人中,我们测量了不同胶质瘤澳门威斯尼人经正常或缺氧处理后分泌的外泌体miR-301a水平。在源自受体缺氧澳门威斯尼人的外泌体中,成熟miR-301a的澳门威斯尼人水平升高(图5A),但未观察到pri-或pre-miR-301a在外泌体摄取方面的变化(图5B)。此外,经外泌体处理的澳门威斯尼人中miR-301a的水平没有受到RNA聚合酶II抑制剂的显著影响(图5C)。我们研究了Wnt/β-catenin的转录活性,以阐明TCEAL7参与exo-miR-301a介导的Wnt/β-catenin信号通路。图5D和图5E显示,miR-301a模拟转染和缺氧胶质瘤澳门威斯尼人源性外泌体暴露显著增加了Wnt/β-catenin信号的表达和转录活性。相反,高水平的TCEAL7降低了miR-301a模拟物或暴露于缺氧外泌体诱导的Wnt/β-catenin活性。同样,在缺氧澳门威斯尼人中抑制TCEAL7可以消除As-miR-301a在TOP-FOP检测中的作用。此外,As-miR-301a和TCEAL7载体挽救了缺氧澳门威斯尼人来源的外泌体对Wnt/β-catenin活性的影响(图5F)。


6.miR-301a参与缺氧外泌体共培养胶质瘤澳门威斯尼人的放射敏化
   为了探讨缺氧的exo-miR-301a水平是否介导胶质瘤澳门威斯尼人的放射敏化,我们检测了澳门威斯尼人辐照后的生存能力。结果表明,缺氧外泌体组与常氧澳门威斯尼人相比,在辐射诱导的存活率方面无明显下降,且表现出抗辐射能力。此外,miR-301a下调或TCEAL7升高显著增加澳门威斯尼人对辐射的敏感性(图6A)。此外,与常氧外泌体组相比,缺氧外泌体组在澳门威斯尼人活力方面不能被进一步抑制;然而,当转染As-miR-301a或TCEAL7载体时,情况发生了逆转(图6B)。我们进一步研究了miR-301a对辐照后澳门威斯尼人凋亡的影响。结果表明常氧外泌体培养组被4-或8-Gy照射诱导的凋亡澳门威斯尼人比例明显高于缺氧外泌体组,另外伴有As- miR -301a或TCEAL7载体时,凋亡能力得到恢复(图6C )。为了便于体外实验,利用U87胶质瘤澳门威斯尼人系建立皮下肿瘤,进一步评估miR-301a在低氧胶质瘤耐辐射中的作用。在异种移植瘤生长试验中,与对照组相比,缺氧外泌体组中辐射不能显著降低肿瘤生长,体外检测分析显示,As-miR-301a或TCEAL7载体增强了肿瘤抑制作用(图6D)。然后进行qPCR检测受Wnt/β-catenin通路转录调控的mRNA水平。Wnt/β-catenin下游基因在缺氧外泌体条件下被激活;然而,As-miR-301a或TCEAL7可以显著抑制过表达(图6E)。

总结:
   exo-miR-301a是缺氧胶质瘤澳门威斯尼人特征性表达和分泌的,是Wnt/β-catenin的一个强有力的调节剂,然后通过靶向抑癌基因TCEAL7降低放疗敏感性。这可能为GBM患者的澳门威斯尼人耐肿瘤治疗放疗提供一个新的靶点。

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