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栏目:最新研究动态 发布时间:2020-04-20
氨气(NH3)是一种已知的有害气体存在于阴霾中,会形成二次有机气溶胶,进入呼吸道对健康产生不利影响......

   NH3是一种已知的有害气体,会对我们的呼吸系统造成伤害。NH3存在于阴霾中,会形成二次有机气溶胶,进入呼吸道对健康产生不利影响。但是,尚未确定由NH3引起的气管的具体损害机制。ceRNA调控机制及其多种作用已在许多病理机制中提出。本文作者以肉鸡为材料,研究了NH3吸入后ceRNA在鸡气管中的功能作用。本文于2019年11月发表在Journal of Hazardous Materials(IF:7.65)上。
本文思路如下图所示:

本文研究结果如下:
1、气管细胞超微结构观察
   如图1,透射电镜下正常对照(C组)气管细胞形态正常,细胞膜边缘清晰完整,线粒体大小正常,无异常结构变化。 然而,NH3暴露组(H组)具有许多细胞坏死的典型特征,包括集中的纤毛细胞核,核仁缺乏,线粒体肿胀,空泡化,甚至细胞质破裂,伴随细胞膜破裂。以上证实,NH 3可以诱导气管细胞坏死。

                                              图1 用透射电镜(TEM)观察暴露于NH3的气管

2、lncRNAs和miRNAs的聚类分析
   RNA测序中鉴定出79个差异澳门威斯尼人官网的lncRNA(DE-lncRNA)(图2A)和21个差异澳门威斯尼人官网的miRNA(DE-miRNA)(图2C)。此外,作者发现lncRNA-107053293和miR-148a-3p(图2 B,红色方框所示)在调控NH3代谢过程中可能是重要的功能原件,因而以此为目标进行下一步分析。

                                              图2 lncRNAs和miRNAs的聚类分析

3、lncRNA-107053293和miR-148a-3p对NH3暴露后气管中FAF1澳门威斯尼人官网的影响
   图3 A是作者筛选的5条显著差异澳门威斯尼人官网的lncRNA进行qRT-PCR验证,其中lncRNA-107053293差异最显著。此外,qRT-PCR显示miR-148a-3p在H组中显著上调澳门威斯尼人官网(图3B)。miR-148a-3p的靶基因FAF1(已知的抑制细胞凋亡)在H组中显著下调澳门威斯尼人官网(图3C和D)。所以作者猜测气管在暴露于NH3引发的凋亡可能与lncRNA-107053293和miR-148a-3p有关。

                                        图3 lncRNA-107053293、miR-148a-3p、FAF1在气管中的澳门威斯尼人官网水平

4、NH3暴露后气管内坏死相关基因的澳门威斯尼人官网
   基于FAF1的表征,作者检测了RIPK1,RIPK3,MLKL,FADD和caspase 8的澳门威斯尼人官网,这些蛋白均与细胞坏死有关。正如预期,暴露于NH3后,气管中RIPK1,RIPK3,MLKL和FADD澳门威斯尼人官网都升高了。并且在mRNA水平上,FADD,RIPK1和RIPK3澳门威斯尼人官网升高超过2倍,而MLKL增加1.5倍,caspase 8减少约60%(图4A)。类似的,上述蛋白的蛋白水平澳门威斯尼人官网趋势得出一致的结论(图4B)。结合前人的研究,caspase 8下调细胞坏死会增加,因此,作者得出结论,NH3暴露后可能通过激活caspase 8引发气管坏死。

                                               图4 检测导致气管组织坏死的基因

5、lncRNA-107053293/miR-148a-3p/FAF1相互作用网络
   亚细胞定位显示lncRNA-107053293主要在细胞质中澳门威斯尼人官网(图5A),之后构建了lncRNA-107053293/miR-148a-3p/FAF1组件,如图5B,双荧光素酶实验显示三者之间确实存在结合位点可相互作用(图5C和D)。
   此外,过澳门威斯尼人官网lncRNA-107053293,miR-148a-3p的澳门威斯尼人官网显著下调,但FAF1澳门威斯尼人官网水平显著升高(图5E和F)。相反,miR-148a-3p过澳门威斯尼人官网lncRNA-107053293和FAF1的丰度都下降了,而FAF1蛋白水平下降的更为明显(图5G)。以上表明, lncRNA-107053293可通过螯合miR-148a-3p来调节FAF1的澳门威斯尼人官网。

                                     图5 lncRNA-107053293/miR-148a-3p/FAF1相互作用网络

6、氯化铵致LMH(鸡肝细胞癌细胞系)坏死
   作者摸索了不同浓度氯化铵用于NH3暴露的最佳浓度,如图6A, 50 mM氯化铵杀死了一半的细胞,所以作者最终选择5 mM浓度的氯化铵,此时细胞存活率大于95%。此外,流式结果显示对照组中只有0.559%的细胞坏死,而当暴露于氯化铵时,有25.3%的细胞坏死(图6B)。

                                                 图6 CCK-8和流式检测的结果
   为了验证上述结果,作者检测了气管细胞中坏死相关基因的mRNA和蛋白质澳门威斯尼人官网,如图7A和B所示,氯化铵模拟的NH3暴露后,组织中FADD和MLKL澳门威斯尼人官网增幅最大,其次是RIPK1和RIPK3。以上结果表明氯化铵可导致细胞坏死。

                                                   图7坏死相关基因的澳门威斯尼人官网
   总之,本文进一步阐明了氨致鸡气管损伤的生物学机制,为氨毒理学研究奠定了更深层次的理论基础。此外,本文的实验手段并不复杂,但发了7分的杂志,值得借鉴。
参考文献:
   Wang Wei., Shi Qunxiang., Wang Shengchen., Zhang Hongfu., Xu Shiwen., (2019). Ammonia regulates chicken tracheal cell necroptosis via the LncRNA-107053293/MiR-148a-3p/FAF1 axis., J. Hazard. Mater., undefined, 121626.

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