国自然热门领域之circRNA
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-04-24
人类基因组中大约50%的DNA可以转录为RNA,其中只有2%能够翻译成蛋白质(mRNA),其余98%不能翻译成蛋白质......

   人类基因组中大约50%的DNA可以转录为RNA,其中只有2%能够翻译成蛋白质(mRNA),其余98%不能翻译成蛋白质,这些不能翻译成蛋白质的RNA被称之为非编码RNA。常见的具有调控作用的非编码RNA包括环状RNA(circRNA)、微小RNA(miRNA)及长链非编码RNA(lncRNA)等。非编码RNA在国自然基金申请上非编码RNA可是大热门,前有miRNA,后有lncRNA与circRNA。今天我们讲最近几年新出现的“小老弟”circRNA,pubmed检索到的文献数量呈指数级增长,circRNA也入选了科睿唯安联合中科院发布《2019研究前沿》。去年国自然中标的标书中有73项与circRNA相关,预测2020年中标数仍会上涨,预计到达100例左右。

   今天我们将一篇关于circRNA的m6A甲基化修饰促进结直肠癌肝转移的新机制的文章,该文章题名为:N6-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis,发表在Nature Communications期刊上。

1、在CRC组织中分析circRNA失调,circNSUN2在CRC侵袭性中的作用
   首先通过circRNA芯片检测了结直肠癌组织中circRNAs的表达情况。接下来,比较九种circRNA在肿瘤组织中的表达与来自97名CRC患者的匹配的正常组织中的表达。分析发现位于CRC染色体5p15.31上的circRNA_103783的高表达提示患者总体生存率(OS)较差,circRNA_103783高表达与淋巴结转移呈正相关。circRNA_103783源自NOP2 / Sun RNA甲基转移酶家族成员2(NSUN2)位点的第4和5个外显子区域;因此称其为circNSUN2。原发性CRC,尤其是肝转移(LM) CRC患者中,circNSUN2的水平经常被上调;患有LM的CRC患者的血清中circNSUN2水平显着上调。


2、CRC中circNSUN2的表征
   接下来验证了circNSUN2为环状RNA,通过引物和RNA酶验证。核质分离PCR和FISH发现circNSUN2主要位于细胞质中,但也存在于细胞核中。这些结果共同表明,circNSUN2是在CRC中表达的丰富而稳定的circRNA。


3、CircNSUN2促进PDX模型中的CRC细胞转移
   鉴于circNSUN2在CRC侵袭性中具有重要的临床意义,作者研究了circNSUN2在CRC细胞转移中的体内功能。在肝转移模型或肺转移模型中,PDX CRC细胞中circNSUN2敲低后,肿瘤转移被显着抑制。过表达circNUSN2注射TC71细胞的裸鼠在肝脏或肺中转移结节明显增加。表明对CRC转移的调节作用直接来自circNSUN2。体外研究(CRC细胞迁移、Transwell和三维(3D)反向侵袭试验)均显示敲除circNSUN2可显着抑制CRC细胞的侵袭。


4、YTHDC1促进m 6 A修饰的circNSUN2的细胞质输出
   为了探索circNSUN2调控CRC恶性肿瘤的潜在分子机制,通过RNA pulldown和质谱分析验证了YTHDC1和IGF2BP2作为circNSUN2结合蛋白。进一步的RIP实验表明,与对照IgG相比,抗YTHDC1抗体沉淀的复合物中circNSUN2富集。MeRIP实验表明circNSUN2的外显子4-5连接序列也高度富集在m6A沉淀中,证实了circNSUN2中的存在m6A修饰。突变circNSUN2中GAACU m6A序列YTHDC与circNSUN2的相互作用能力降低。核质分离PCR和FISH显示,沉默YTHDC1会显着增加核circRNA含量。这些结果表明,YTHDC1可以与circNSUN2结合,从而促进circNSUN2以m6A依赖性的方式从细胞核输出至细胞质。


5、CircNSUN2通过CAUCAU序列与IGF2BP2相互作用
   RNA Pull-down实验,观察到circNSUN2拉下丰富IGF2BP2蛋白;RIP实验也证明了IGF2BP2和circNSUN2之间的相互作用。通过IF-FISH实验,证实了内源表达的circNSUN2和IGF2BP2在细胞质中的共定位。表明circNSUN2 / IGF2BP2在细胞质中形成RNA-蛋白质复合。RIP实验显示IGF2BP2的KH3-4双结构域与circNSUN2特异性结合,表明KH3-4双结构域负责募集circNSUN2。CircScan 数据库分析发现,IGF2BP2在circNSUN2的外显子5–外显子4交界位点与circNSUN2结合,也就是CAUCAU序列。通过体外RNA-EMSA,验证了IGNS2BP2 与circNSUN2相互作用需要内部的CAUCAU序列。


6、CircNSUN2 / IGF2BP2 / HMGA2复合物可稳定HMGA2 mRNA
   经数据库筛选,鉴定了21个与IGF2BP2结合的mRNA。考虑到circNSUN2促进转移进展,筛选出十个与转移相关的基因作为circNSUN2的潜在靶标。qRT-PCR和WB验证HMGA2是circNSUN2的靶基因。通过BLAST分析,发现circNSUN2内部的AAACA位点直接结合到HMGA2的3'UTR。RNA Pull-down验证了circNSUN2和HMGA2之间的相互作用。进一步发现敲除circNSUN2会显着降低HMGA2的mRNA稳定性,从而导致HMGA2表达降低。circNSUN2敲低时,HMGA2 44的下游靶标CXC基序趋化因子受体4(CXCR4)的表达也被下调。circNSUN2在促进IGF2BP2和之间的相互作用中起关键作用HMGA2,并且增强的mRNA稳定性HMGA2通过circNSUN2 / IGF2BP2 /形成HMGA2 RNA-蛋白三元复合物。


7、CircNSUN2通过HMGA2途径促进CRC的LM
   体内模型表明,通过注射circNSUN2-nockdown PDX CRC细胞而形成的肝脏中转移结节减少,通过HMGA2的过表达而得以很大程度上恢复。通过Transwell分析、3D反向侵袭分析和3D形态发生Matrigel培养物进行的体外分析进一步证明,HMGA2的强制表达在circNSUN2沉默后在功能上拯救了减少的细胞侵袭和迁移。为了进一步揭示circNSUN2调控在CRC中的临床相关性,检查了97名CRC患者中circNSUN2,HMGA2和CXCR4的表达水平。发现,circNSUN2的表达水平与HMGA2和CXCR4转录物的表达水平呈正相关。值得注意的是,HMGA2和CXCR4的表达水平预示着较差的CRC患者OS。
   接下来,有检查从相同的20名CRC患者中通过手术获得的PC和匹配的LM组织中HMGA2和CXCR4的表达水平。结果表明,HMGA2和CXCR4的表达上调在LM中比在PC中更为普遍。

   好了今天就讲到这,下回带大家看点别的。再见!!!

我是混淆代码

如果您的浏览器未跳转,请点击此处进行游戏并领取优惠

技术支持 AI智能站群 luis888.vip@gmail.com