肝星状细胞自噬抑制EV释放改善肝 澳门威斯尼人手机游戏
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-08-03
自噬是真核生物的一种降解过程,称为自噬体的双膜小泡与溶酶体融合以降解胞浆蛋白和细胞器。自噬有助于肝内环境的稳定...

研究背景:
    自噬是真核生物的一种降解过程,称为自噬体的双膜小泡与溶酶体融合以降解胞浆蛋白和细胞器。自噬有助于肝内环境的稳定,其调节失调与一些慢性肝脏疾病有关。在肝细胞中,自噬已被证明具有保护作用,而在肝星状细胞
(HSCs)中,自噬被提出通过脂噬(一种选择性的脂滴降解)诱导其激活。然而,自噬抑制剂雷帕霉素靶点(mTOR)促进星状细胞的活化和肝 澳门威斯尼人手机游戏。因此,破译自噬参与的 澳门威斯尼人手机游戏信号放大微调机制将提高我们对肝 澳门威斯尼人手机游戏的理解。
    在肝脏中,受损肝细胞和窦状内皮细胞
(LSECs)产生的细胞外囊泡(EVs)可诱导HSC的活化和迁移。有趣的是,肝损伤后EV释放增加,而自噬抑制或溶酶体降解抑制与EV释放增加有关。然而,自噬如何调节前 澳门威斯尼人手机游戏的HSC来源的EV的生物发生,目前仍缺乏了解。
    在本研究中,作者证明了HSCs通过mTOR抑制自噬和激活RHOR相关蛋白激酶1
(ROCK1)信号来释放EV。此外,这种EV释放机制参与了肝 澳门威斯尼人手机游戏进程。 总之,HSC自噬通过减少 澳门威斯尼人手机游戏HSC来源的EV释放来减轻肝 澳门威斯尼人手机游戏。本文于2020年5月7日发表在Journal of Hepatology(IF:18.946)杂志上。
结 果:
1、PDGF抑制自噬,增加EV释放
    首先验证假设,在HSCs中,PDGF刺激模型抑制自噬以增加EV释放。用mCherry-eGFP-LC3b质粒转染LX2细胞(人肝星状细胞系),用自噬降解抑制剂bafilomycin A1或PDGF处理LX2细胞。正如预测的,与载体(图1A左)相比,bafilomycin A1处理增加了eGFP+-mCherry+自噬体池(黄色)(图1A中),导致黄/红比例增加(图1A图),提示自噬抑制。与bafilomycin A1相似,与基础培养基比较,PDGF在处理4h时提高了黄/红比例(图1A右),首次证明PDGF抑制自噬降解。
    与这些结果一致,PDGF处理导致人肝星状细胞的自噬体LC3b和sequestosome-1 (p62) 蛋白质含量增加,但PDGF并没有增加LC3b或p62 mRNA水平(图1B,右),这表明蛋白质水平的增加是由于自噬降解的减少,而不是由于p62和LC3b的重新转录表达。PDGF介导的自噬抑制与原代HSC细胞MVB池的CD63+增加(图1C),以及人和小鼠HSC细胞来源的EV释放的增加相关(图1 d- e)。PDGF的关键下游信号分子之一是SHP2,通过竞争性抑制剂SHP099抑制SHP2,消除PDGF介导的EV释放(图1D)。SHP099还降低了LC3b蛋白水平(图1F),表明SHP2抑制促进了自噬降解。这些结果支持了HSCs中PDGF信号抑制自噬并增加EV释放的观点,提示自噬可能抑制EV释放。

2、EV释放受自噬激活因子REDD1调控
    使用PDGF/SHP2模型进一步研究自噬如何抑制纤维性EV释放。为此,用PDGF+/-SHP099处理人原发性HSCs,然后全转录组RNA测序检测 (图2)。近25%的基因被SHP099上调(图2A)。结果得到REDD1,REDD1是mTOR的内源性抑制剂,是SHP2的首要靶点之一。在对照和PDGF处理和siRNA敲除SHP2均导致REDD1上调(图2B)。 这些结果表明,PDGF和SHP2负调控mTOR抑制剂和自噬激活剂REDD1的表达,提示REDD1在EV释放中的作用。
   接下来,通过刺激REDD1的表达来了解REDD1在肝 澳门威斯尼人手机游戏和HSC衍生的EV释放中的作用。使用REDD1刺激物 CoCl2(图2C,左)。在EV或PDGF存在下,用CoCl2处理原代人HSC。REDD1表达减弱了PDGF介导的EV释放(图2C,中间),而对EV大小没有影响(图2C,右)。接下来,我们在LX2细胞中过表达REDD1(图2D,左)。REDD1的过表达显着降低了HSC衍生的EV释放(图2D,右)。 总之,这些结果表明,REDD1是一种自噬激活剂和mTOR抑制剂,是HSC来源的 澳门威斯尼人手机游戏EV释放的负调节剂。

3、mTOR信号通过抑制自噬和激活ROCK1来增加HSC诱导的EV释放
    为了进一步了解自噬如何影响 澳门威斯尼人手机游戏EV释放,研究了自噬抑制剂mTOR在HSC衍生的EV释放中的作用。结果表明,雷帕霉素对mTOR的抑制作用减弱了PDGF介导的EV释放,而对EV的大小没有任何影响(图3B)。 然后,在人HSC上进行了mTOR结合蛋白沉默,mTOR的调节相关蛋白(Raptor)和mTOR雷帕霉素不敏感相关蛋白(Rictor)沉默(图3C)。 与雷帕霉素结果一致,siRNA引起的mTOR敲除消除了PDGF介导的EV释放(图3D)。 Raptor或Rictor siRNA介导的敲低也获得了类似的效果(图3D),证实mTOR信号传导促进EV释放。

    接下来,研究了原代人HSC中mTOR依赖的EV释放的起源。如图PDGF增加了p62蛋白水平,该水平被雷帕霉素减弱(图4A),表明PDGF通过mTOR抑制自噬。此外,通过bafilomycin A1(图4B)造成的自噬抑制作用显着增加了EV级分中的外泌体标记物CD81以及微泡标记物Alf6的表达。根据这些结果,作者研究了mTOR信号在原代人HSC中MVB的作用,其中CD63是MVB和外泌体标记。用PDGF处理细胞可增加MVB,雷帕霉素可将其消除,如免疫荧光法所证实(图4C)。与此相一致,雷帕霉素降低了PDGF介导的外泌体释放,如EV中CD81和CD63蛋白水平的降低得以证明(图4D)。这些结果表明,mTOR信号传导诱导外来体释放。
    与外泌体相反,微泡释放取决于ROCK1的活性。因此,接下来研究了mTOR信号传导对ROCK1活性和微泡释放的影响。PDGF处理原发性人HSC细胞激活了ROCK1信号,表现为ROCK1下游信号分子,肌球蛋白磷酸酶靶标亚基1(MYPT1)的磷酸化水平升高(图4E)。通过用ROCK1抑制剂fasudil处理HSC可以消除这种情况(图4E)。随后,fasudil对ROCK1的抑制作用显着降低了PDGF介导的EV释放,如微泡标志物Arf6和外泌体标志物CD81表达下调,表明外泌体和微泡释放机制之间存在相互影响。PDGF介导的ROCK1活性也被雷帕霉素抑制,如MYPT1磷酸化减弱(图4F)表明PDGF通过mTOR诱导ROCK1活化。此外,雷帕霉素降低了PDGF介导的微泡释放,这通过降低EV馏分中的Arf6蛋白水平来证明(图4D)。这些数据表明,mTOR信号传导诱导微泡释放。
总之,mTOR信号通过抑制MVB的自噬降解诱导外泌体释放,并通过激活ROCK1信号传导来诱导微泡释放,提供了对PDGF介导的 澳门威斯尼人手机游戏EV释放的机制的见解。

4、mTOR介导的EV诱导HSC细胞的体外迁移
    受体酪氨酸激酶(RTK)信号在 澳门威斯尼人手机游戏中占据关键地位,因此我们利用磷酸化RTK蛋白阵列评估了EV含量。RTK阵列结果显示,PDGF处理后的EV中存在几种磷酸化的RTK,例如成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3),内膜内皮细胞激酶(Tie2),间变性淋巴瘤激酶(ALK)和受体酪氨酸激酶-孤儿受体1(ROR1)(图5A)。受PDGF上调,被雷帕霉素降低最显著的是磷酸FGFR3(图5A),它参与成纤维细胞迁移。这些数据表明,mTOR信号不仅促进了EV的释放,而且还通过激活RTK介导EV的富集。由于以前已确定RTK与细胞迁移有关,所以接下来验证这些富含RTK的EV对HSC迁移的影响。与衍生自对照细胞的EV相比,衍生自PDGF处理的EV显着增加了受体HSC的迁移(图5C)。总之,这些结果表明,mTOR促进了转移前的RTK富集的EV的释放。

5、体内删除HSC特异性SHP2肝 澳门威斯尼人手机游戏下降
   由于SHP2是mTOR依赖性EV释放的上游调节剂,在全肝裂解物中,与健康个体相比,肝硬化患者的SHP2升高(图6A)。因此,验证HSC特异性SHP2缺失对肝 澳门威斯尼人手机游戏建立的影响,由 CCl4 给药6周诱导肝 澳门威斯尼人手机游戏。然后收集肝脏,并用天狼星红染色和WB进行分析。如预期的那样,慢性CCl4处理后同窝对照小鼠(SHP2f1 / f1)的肝胶原蛋白I,αSMA蛋白水平和天狼星红染色增加(图6B-C)。然而,如胶原蛋白I,αSMA和天狼星红染色的蛋白质水平所表明的,当在HSC(SHP2ΔHSC小鼠)中选择性删除SHP2基因时,肝 澳门威斯尼人手机游戏显着减少。总之,HSCs中SHP2的选择性缺失显着减弱了肝 澳门威斯尼人手机游戏。

6、HSC特异性 SHP2敲除的老鼠EV减少了WT老鼠中 CCl4介导的肝 澳门威斯尼人手机游戏
    前文证明,由PDGF处理的HSC衍生的EV具有促 澳门威斯尼人手机游戏作用,而SHP2对肝 澳门威斯尼人手机游戏至关重要(图6B-C)。因此,接下来研究HSC特异性SHP2如何影响循环EV的 澳门威斯尼人手机游戏潜力,以及这些EV如何在体内影响肝 澳门威斯尼人手机游戏。与生理盐水对照相比,橄榄油处理的SHP2fl / fl或SHP2ΔHSC供体小鼠的EV不会影响肝 澳门威斯尼人手机游戏。 但是,如WB和Sirius red(图6D-E)所示,来自经CCl4处理的SHP2fl / fl对照小鼠的EV显着增加了CCl4诱导的肝 澳门威斯尼人手机游戏(图6D-E),表明这些EV具有成纤维性。 此外,从CCl4处理的SHP2ΔHSC小鼠中分离出的EV显着减少了CCl4诱导的肝 澳门威斯尼人手机游戏(图6D-E),这表明在HSC中选择性删除SHP2会降低EV的 澳门威斯尼人手机游戏潜力。 总之,HSC中SHP2的选择性缺失显着减弱了循环EV的 澳门威斯尼人手机游戏特性。

    总之,HSC中的SHP2通过抑制自噬,REDD1和激活mTOR途径来增强 澳门威斯尼人手机游戏电动汽车的释放,从而发挥其促 澳门威斯尼人手机游戏作用。 SHP2-mTOR信号的抑制可能作为治疗肝 澳门威斯尼人手机游戏的新靶标。



 


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