外泌体circSHKBP1与胃癌进展间关系大揭秘
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-08-21
circRNAs(circRNAs)在多种癌症的发生发展中起着重要的调控作用。然而,circRNAs在胃癌(GC)中的生物学功能及其分子机制尚不清楚...

        circRNAs(circRNAs)在多种癌症的发生发展中起着重要的调控作用。然而,circRNAs在胃癌(GC)中的生物学功能及其分子机制尚不清楚。今天小编为大家带来发表于“molecular cancer”上的文章“Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation”,为大家详细介绍circSHKBP1在胃癌发展中的机制。

        在本研究中,通过RNA测序鉴定差异澳门威斯尼人的环状RNA。通过一系列体外和体内实验研究了circSHKBP1在GC中的生物学功能。通过实时定量PCR和RNA原位杂交检测circSHKBP1的澳门威斯尼人,通过western blot、pull down、RNA免疫沉淀、荧光素酶检测和挽救实验证实了circSHKBP1的分子机制。最后,使用小鼠异种移植和生物发光成像检查体内circSHKBP1的临床相关性。我们的研究结果表明,外泌体circSHKBP1调控miR-582-3p/HUR/VEGF通路,抑制HSP90降解,并促进GC进展。
结 果:

1.circSHKBP1作为GC生物标志物的鉴定
        通过对GC组织和匹配的相邻正常组织的RNA测序分析,我们共鉴定出1445个不同的circRNA。共有119个circRNAs在癌组织和正常组织中有差异澳门威斯尼人,其中5个circRNAs上调,114个circRNAs下调(图1a和b)。然后,我们进一步通过qRT-PCR分析,发现circSHKBP1是GC中澳门威斯尼人差异最大的circRNA(图1c)。
        CircSHKBP1来源于蛋白编码位点SHKBP1,在人类组织中广泛澳门威斯尼人。CircSHKBP1是由SHKBP1基因的第11和第12外显子与两侧内含子中的几个Alu元件反向剪接而产生的(图1d)。我们设计了跨越连接位点的聚合引物,通过Sanger测序证实了逆转录产物(图1e)。然后,我们分析了circSHKBP1在配对GC组织和正常组织中的澳门威斯尼人情况。qRT-PCR分析显示,与正常组织相比,在GC组织中circSHKBP1澳门威斯尼人上调(图1h,i)。此外,ISH检测显示,circSHKBP1在GC组织中的丰度远高于匹配的正常组织(图1f),并且circSHKBP1的澳门威斯尼人与TNM晚期、血管侵犯和不良预后相关(图1g)。接着,鉴定了来自血清的外泌体中的circSHKBP1。与预期的一样,来自血清外泌体的circSHKBP1在GC患者中比健康对照组更丰富(图1j)。此外,血清外泌体中的circSHKBP1水平与胃癌患者肿瘤中的水平一致,约为肿瘤中的水平的6倍(图1k)。我们还研究了胃癌切除术前后血清中circSHKBP1的澳门威斯尼人,发现肿瘤切除后circSHKBP1的澳门威斯尼人急剧下降,表明胃癌组织是外泌体circSHKBP1的来源(图1l)。这些结果表明circSHKBP1是一种来自GC组织的上调的circRNA,circSHKBP1的高澳门威斯尼人与TNM晚期及胃癌不良预后相关。

2.CircSHKBP1在体外促进GC细胞的增殖、迁移和侵袭
        为了研究circSHKBP1是否影响胃癌细胞的生物学过程,我们首先分析了circSHKBP1在人胃癌细胞系和胃正常上皮细胞系GES1中的澳门威斯尼人情况。与GES1细胞相比,circSHKBP1在4种GC细胞系中均过澳门威斯尼人,在BGC823和HGC27的澳门威斯尼人尤为明显(图2a)。与GES1细胞相比,外泌体circSHKBP1在GC细胞系中也过澳门威斯尼人(图2b-d)。因此,我们在接下来的分析中使用了BGC823和HGC27细胞。
        接着,我们对circSHKBP1进行了干扰。 CCK8和EdU检测显示,沉默circSHKBP1显著抑制了GC细胞的增殖(图2e,f,i)。Transwell检测显示,沉默circSHKBP1抑制了GC细胞的迁移和侵袭能力(图2j,k)。然而,过澳门威斯尼人circSHKBP1增加了GC细胞的增殖、迁移和侵袭(图2g,h,l-n)。
        最后,我们从转染circSHKBP1质粒的BGC823和HGC27细胞的培养液中提取外泌体,并与不同浓度未处理的GC细胞共培养。正如预期的那样,外泌体circSHKBP1的过澳门威斯尼人也影响了GC细胞的增殖、迁移和侵袭,促进了恶性细胞表型(图2o-q)。这些结果表明circSHKBP1促进了GC细胞的生长和转移。

3.CircSHKBP1作为miR-582-3p的海绵
        为了研究circSHKBP1在GC细胞中的作用机制,我们首先确认了它在GC细胞中的定位。FISH分析和qRT-PCR分析表明,circSHKBP1优先定位于GC细胞的细胞质内(图3a和b)。鉴于circRNAs作为miRNA海绵已被广泛研究,我们接下来研究了circSHKBP1的miRNA结合能力。我们进行RIP检测,观察到在BGC823细胞中内源性circSHKBP1下拉,被特异性地富集(图3c),这表明circSHKBP1起着miRNA海绵的作用。四个可能的miRNAs(miR-582-3p,miR-665,miR-1207和miR-4458)被预测。我们检测到这些miRNAs在circSHKBP1过澳门威斯尼人的GC细胞中的澳门威斯尼人,发现miR-582-3p和miR-665下调(图3d)。为了验证miR-582-3p/miR-665和circSHKBP1之间的直接相互作用,我们进行了双荧光素酶报告基因检测(图3e)。结果表明,与miR NC模拟物相比,miR-582-3p模拟物使circSHKBP1-miR-582-3p组的相对荧光素酶活性降低,而circSHKBP1-miR-582-3p突变体组的荧光素酶活性没有变化(图3f)。我们还进行了生物素标记的RNA下拉试验,证实了circSHKBP1和miR-582-3p的吸收(图3g)。此外,FISH实验证实了circSHKBP1和miR-582-3p在细胞质中共定位(图3h)。qRT-PCR显示,GC肿瘤中miR-582-3p水平低于配对正常组织,miR-582-3p与circSHKBP1的澳门威斯尼人呈负相关(图3i和j)。
        最后我们证实miR-582-3p的生物学功能。CCK8和Transwell分析表明miR-582-3p模拟物抑制了GC细胞的增殖、迁移和侵袭,而circSHKBP1的过澳门威斯尼人消除了这种对GC细胞发育的抑制作用(图3k-m)。

4.CircSHKBP1通过上调HUR促进VEGF的翻译
        通过生物信息学分析网站,我们发现了54个miR-582-3p候选靶蛋白(图4a),其中HUR和EIF2S1被报告为VEGF信号通路的一部分。血管内皮生长因子(VEGF)是促进内皮细胞增殖的重要因素之一,因此我们对VEGF途径进行了深入研究。WB分析显示,过澳门威斯尼人circSHKBP1增加了HUR和VEGF的水平(图4b)。此外,miR582-3p模拟物降低了HUR和VEGF蛋白水平(图4b)。同样,沉默circSHKBP1降低了HUR和VEGF的水平,miR-582-3p抑制剂恢复了这些水平(图4c)。与对照组相比,HUR的RIP显示VEGF mRNA和miR-582-3p显著富集(图4d和e),进一步证实HUR是miR-582-3p的靶点,HUR直接与VEGF mRNA结合。我们还检测了GC组织中HUR mRNA的水平,发现HUR的澳门威斯尼人与miR-582-3p呈负相关,而与CircSHKBP1呈正相关(图4f和g)。我们用不同浓度的贝伐单抗处理CircSHKBP1过澳门威斯尼人的GC细胞,以确定CircSHKBP1是否通过VEGF加速肿瘤进展。WB分析显示,VEGF水平随着贝伐单抗浓度的增加而降低(图4h)。贝伐单抗以浓度依赖的方式降低GC细胞增殖和迁移能力(图4i-k),并且CircSHKBP1过澳门威斯尼人细胞的抑制率远高于对照组(图4l)。试管形成试验进一步证实,CircSHKBP1促进VEGF分泌并诱导血管生成,贝伐单抗可抑制这一点(图4m和n)。

5.CircSHKBP1直接与HSP90相互作用并抑制其降解
        我们设计了一种特异性生物素标记的CircSHKBP1探针,用于HGC27细胞的RNA下拉分析。银染结果显示,与对照组相比,CircSHKBP1过澳门威斯尼人的GC细胞中多个蛋白条带的富集(图5a)。蛋白质质谱分析用于鉴定差异澳门威斯尼人的蛋白质。HSP90β 和HSP90α排名前两位,都是HSP90的亚型。RIP分析显示,与IgG相比,抗HSP90抗体拉下了丰富的CircSHKBP1(图5c),证实了CirchHKBP1和HSP90之间的直接相互作用。通过TCGA分析,HSP90在GC中上调(图5d)。采用qRT-PCR方法检测组织中HSP90 mRNA水平,ELISA法检测组织中HSP90蛋白水平。结果表明,与正常组织相比,GC肿瘤中HSP90 mRNA和蛋白均上调(图5e,f)。考虑到circRNA和蛋白质之间的相互作用,我们分析了HSP90蛋白的澳门威斯尼人与CircSHKBP1之间的关系,发现它们是正相关的(图5g)。WB显示CircSHKBP1的过澳门威斯尼人略微增加了HSP90的总量(图5e)。然而,用CHX抑制蛋白质合成后,当CircSHKBP1过澳门威斯尼人时,HSP90的降解被显著抑制(图5h)。E3泛素连接酶STUB1已被证明泛素化HSP90。因此,我们使用蛋白酶体抑制剂MG132来阻断HSP90的泛素化。在MG132处理下,HSP90的降解减慢(图5i)。IP分析显示过澳门威斯尼人CircSHKBP1降低了与HSP90结合的STUB1数量(图5j和k)。此外,HSP90的选择性抑制剂NMS-E973在体外损害了CircSHKBP1circhkbp1的促肿瘤功能(图5l-n)。这些结果表明,circSHKBP1直接与HSP90结合,通过STUB1抑制HSP90的泛素化,从而促进GC的发育。

6.CircSHKBP1促进体内GC生长
        我们构建了沉默和过澳门威斯尼人CircSHKBP1的细胞株。将LV3-sh1、LV3-sh2和LV3-NC细胞接种于裸鼠右大腿皮下。结果表明,在肿瘤体积和肿瘤重量/体重比方面,LV3-sh1细胞的肿瘤明显小于LV3-NC细胞(图6a,b)。另外,我们将LV5- CircSHKBP1和LV5-NC细胞接种于裸鼠右大腿皮下,每组半数小鼠每周给予贝伐单抗两次。经过21天的监测,来自LV5- CircSHKBP1细胞的肿瘤比来自LV5-NC细胞的肿瘤体积更大、重量更重。此外,贝伐单抗显著抑制肿瘤生长(图6c,d)。通过对小鼠血清和肿瘤中的蛋白质进行WB分析,我们发现,与LV3-NC组相比,LV3-sh1和LV3-sh2组的HUR和VEGF水平降低(图6g和h);与LV5-NC组相比,LV5- CircSHKBP1组的HUR和VEGF增加,而VEGF被贝伐单抗抑制(图6e和f)。肿瘤组织中HUR和VEGF的IHC结果相似(图6i-l)。接下来,我们从血清外泌体和肿瘤中提取总RNA,用qRT-PCR方法研究circSHKBP1。结果表明,外泌体circSHKBP1的澳门威斯尼人与癌组织CircSHKBP1的澳门威斯尼人呈线性关系(图6m)。我们还测量了肿瘤中miR-582-3p的水平,发现它与circSHKBP1的水平呈负相关(图6n)。此外,CD31在肿瘤中的IF显示LV5-circSHKBP1组的荧光区明显大于对照组(图6o和p),表明血管生成活跃。

7.CircSHKBP1促进体内GC转移
        为了研究circSHKBP1在体内的转移潜能,我们首先用荧光素酶质粒稳定转染上述5种细胞系,然后通过尾静脉注射到裸鼠体内。LV5- circSHKBP1和LV5-NC组半数小鼠每周给药两次贝伐单抗。结果表明,circSHKBP1基因敲除可显著减少肺转移病灶的数量和大小(图7a-c)。此外,IHC显示circSHKBP1敲低导致GC肺转移灶HUR和VEGF染色明显减少(图7d)。生物发光成像和HE染色显示,circSHKBP1的过澳门威斯尼人加重了肺转移病灶,HUR和VEGF染色增加(图7e-h)。贝伐单抗也能抑制circSHKBP1的转移潜能。

结 论:
        总之,我们证明circSHKBP1在GC患者中上调,并与TNM分期、血管侵犯和不良预后有关。以circSHKBP1为靶点的血清外泌体液体活检可以帮助诊断和预测胃癌的进展。CircSHKBP1通过吸收miR-582-3p来上调HUR和VEGF,并通过与STUB1竞争来诱导HSP90,从而促进GC进程。因此circSHKBP1被认为是一种很有前途的胃癌诊断和预后的生物标志物,是胃癌治疗的潜在治疗靶点。


 


我是混淆代码

如果您的浏览器未跳转,请点击此处进行游戏并领取优惠

技术支持 AI智能站群 luis888.vip@gmail.com