microRNA的一种非典型分子机制——维持血管完整性
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-09-08
MicroRNAs (miRNAs)是多种基因表达的调控因子,对包括动脉粥样硬化在内的人类疾病有着深远的影响,但它们是否能够发挥翻译后功能来控制细胞适应,以及这些非典型特征是否具有病理生理相关性尚不清楚...

    MicroRNAs (miRNAs)是多种基因表达的调控因子,对包括动脉粥样硬化在内的人类疾病有着深远的影响,但它们是否能够发挥翻译后功能来控制细胞适应,以及这些非典型特征是否具有病理生理相关性尚不清楚。近期,来自慕尼黑大学心血管预防研究所的Donato Santovito团队发表在Science Translational Medicin上的研究证明miR- 126-5p在高剪切应力和自噬环境下维持内皮完整性。在自噬小泡表面,miR-126-5p结合argonaute-2 (Ago2)后与Mex3a形成复合物,被引导转运至细胞核。在细胞核中,miR-126-5pAgo2分离,并通过其种子序列与caspase-3结合,阻止caspase二聚并抑制其活性,从而限制细胞凋亡。

技术路线:

研究结果:
1.高剪切应力(HSS)和自噬促进细胞核miR-126-5p的富集
    在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中过表达KLF2(KLF2在动脉内皮细胞中协调大部分由剪切应力诱发的转录程序),显示出pre-miR-126和miR-126-5p表达量增加(图1A)。在具有EC特异性Klf2缺失的Cdh5CreKlf2fl / fl小鼠的主动脉内膜中检测到了较低的miR-126-5p(图1B)。 KLF2过表达和HSS(12 dyne/cm2)增加自噬相关基因(ATG)的转录并促进自噬通量,通过蛋白质而不是转录本水平如微管相关蛋白LC3-I转化为自噬体相关蛋白LC3-II和自噬底物p62的减少来实现(图1C和D)。澳门威斯尼人霉素对miR-126-5p具有显着的核定位作用(图1F-H)。qPCR证实了澳门威斯尼人霉素诱导的内源性miR-126-5p的核富集(图1I)。使ATG5和ATG7沉默或使用a/b 输入蛋白抑制剂伊维菌素可防止miR-126-5p核积累(图1J)。用3-甲基腺嘌呤限制自噬降低了KLF2驱动的核miR-126-5p的积累(图1K)。总之,由KLF2或mTOR抑制触发的自噬控制着miR-126链的运输,并通过核转移保留了miR-126-5p。

2.miR-126-5p的核转移需要RNA结合蛋白Mex3a
    澳门威斯尼人霉素引起AGO2和LC3的核积累,这被伊维菌素阻断(图3A)。 RNA免疫沉淀(IP)证实了miR-126-5p与核AGO2的优先结合(图3B)。在纳米水平上,在澳门威斯尼人霉素处理的EC中,在外表面而不是在LC3标界的囊腔中可检测到AGO2(图3C)。用胰蛋白酶孵育分离的自噬体可剂量依赖性地降低AGO2的量,但不会降低LC3-II的量,因此进一步支持了AGO2在膜外表面的定位。总之,我们的数据支持这样的概念,即在自噬体表面上AGO2:miR-126-5p复合物会促进核易位。进行了AGO2-IP识别相互作用的蛋白质。尽管两者相邻,在澳门威斯尼人霉素处理过的细胞的AGO2免疫沉淀物中未检测到LC3,核AGO2导航因子TNRC6A和importin-8也未检测到(图3D),因此排除他们的参与。Co-IP揭示了细胞质和细胞核中AGO2和Mex3a的相互作用,这通过自噬EC的共聚焦显微镜得到了证实(图3D和E)。使用受激发射损耗(STED)纳米显微镜来观察该复合物,证实了AGO2和Mex3a的共定位信号,而LC3信号仅显示邻近性(图3F)。

3.Mex3a优先与miR-126-5p结合
    接下来,证明了Mex3a的RNA结合,这是由两个K同源(KH)域赋予的。核磁共振(NMR)滴定表明异质串联KH结构域与miR-126-5p结合,符合亚微摩尔亲和力(图4A)。表面等离子体共振(SPR)证实全长Mex3a与固定的miR-126-5p具有高亲和力结合(图4B)。为了验证两个KH域如何发生miR-126-5p结合的结构调节,进行了小角度X射线散射(SAXS),以显示自由的KH1和KH2串联域是灵活连接的,类似于线上的珍珠,然而,当它们与miR-126-5p结合时,它们形成了紧凑的结构(图4C)。使用计算机模型估计的结合自由能(BFE)表明5p链比3p链优先结合(图4D),这与NMR滴定的光谱变化减少一致。通过固定的Mex3a上的SPR,等温滴定量热法(ITC)和暴露于核裂解液后miR-126链的pulldown实验证实miR-126-5p的优先结合(图4D)。同样澳门威斯尼人霉素处理的内皮细胞中核Mex3a的RNA-IP揭示了miR-126-5p的优先富集(图4E)。 SPR显示AGO2:Mex3a相互作用仅在存在miR-126-5p时发生,在固定化或溶液中都表明复合物中三元相互作用的特异结合(图4F和G)。沉默Mex3a消除了澳门威斯尼人霉素诱导的AGO2和LC3积累(图4H)和EC细胞核中miR-126-5p的富集(图4I)。总之,确定了miR-126-5p:AGO2复合物的核穿梭作用是由Mex3a依赖性过程介导的。

4.核miR-126-5p具有抗凋亡特性
    通过研究短期接触澳门威斯尼人霉素后miR-126-5p的基因表达变化以及miR-126-5p的功能得失来研究核miR-126-5p转移的转录效应。涉及EC生物学的多个转录物的表达发生了变化,分析了澳门威斯尼人霉素和miR-126-5p模拟物进行一致调节的那些功能注释(图5A)。对KEGG途径富集的分析揭示了对凋亡相关途径转录谱的主要影响(图5B),所以在蛋白质水平上研究了凋亡介体。 miR-126-5p的过表达仅略微减弱了caspase-3 / 9的表达,但显着降低了caspase-3的活性形式及其底物的裂解,这一作用需要澳门威斯尼人霉素的存在来诱导miR-126-5p的核转移,并且在miR-126-5p抑制后未观察到(图5C)。通过Mex3a下调阻止miR-126-5p的核富集会增加caspase-3的裂解物(图5D)。通过使miR-126-5p或Mex3a沉默可以防止澳门威斯尼人霉素处理后EC细胞凋亡的减少(图5E和F)。同样,miR-126-5p沉默会削弱Mex3a过表达介导的抗凋亡作用(图5G)。

5.与caspase-3的直接相互作用传达了miR-126-5p的抗凋亡作用
    抗凋亡作用在澳门威斯尼人霉素处理后迅速发生,并且在相关介体中发生转录变化,从而推测了miR-126-5p具有抗凋亡特性。因此,测试了与miR-126-5p复合物的潜在相互作用。通过共聚焦显微镜获得的FISH显示了miR-126-5p和caspase-3的共定位信号,特别是在核和核周区域,并且通过Mex3a下调降低了这种共定位(图6A-C)。在澳门威斯尼人霉素处理或HSS条件下RNA-IP显示出与核caspase-3相关的miR-126-5p显着富集(图6D)。使用澳门威斯尼人霉素处理的EC核提取物中miR-126-5p的pulldown检测到caspase-3和Mex3a(图6E)。caspase-3与荧光标记的合成miR-126-5p的共定位可通过部分或完全破坏种子序列(Mut1和Mut2)或更广泛的突变(Mut3)来降低(图6F)。加入miR-126-5p后caspase-3甲基信号的实质光谱变化以及加入caspase-3后的RNA信号均表现出两者直接结合(图6G)。为了验证miR-126-5p可以与AGO2解离而与caspase-3结合,对固定的miR-126-5p进行了竞争分析,结果表明caspase-3取代了AGO2与miR-126-5p的结合(图6H)。SPR揭示了miR-126-5p剂量依赖性地破坏了caspase-3p17亚基的二聚化(图6I)。在无细胞试验中,miR-126-5p剂量依赖性地减少重组caspase-3的裂解物,其最大抑制浓度(IC50)与VAD或DEVD的抑制作用相当(图6J),支持miR-126-5p干扰结合口袋和异二聚体的活性位点形成的观点。种子序列突变的miR-126-5p(从Mut1到Mut3),miR-126-3p,let-7a-5p,miR-17-5p和miR-21-5p的计量改变对caspase-3无效(图6J)。总的来说,这些数据表明,在Mex3a引导下的核miR-126-5p与AGO2分离后,可以通过直接抑制caspase-3保护EC不受凋亡的影响。

6.miR-126-5p:Mex3a通路在体内和人类疾病中起作用
    为了研究自噬驱动途径与血管疾病相关的体内证据,通过三维(3D)反褶积免疫荧光分析了易患动脉粥样硬化的Apoe-/-小鼠主动脉中LC3内皮细胞染色模式。 LC3染色在暴露于HSS的区域比LSS的情况更为普遍(图7A和B)。由于脂蛋白会在体外触发EC的自噬,因此分析了高脂饮食(HFD)的作用。HFD持续12周即可显着增加内皮LC3染色(图7A和B)。此外,在LSS区域,相比于在HSS区域中,LC3的核定位并不普遍并且核Ago2 + EC的百分比则较低(图7C-E)。非病变的人颈动脉分叉上游(暴露于HSS)的内皮细胞比分叉下游的动脉粥样硬化区表现出更明显的核AGO2定位(图7F和G)。此外,共聚焦反褶积显微镜揭示了EC核中Mex3a和miR-126-5p的紧密定位信号(图7H)。发现在未患病血管区域的EC中,Mex3a和miR-126-5p之间的相互作用距离比覆盖动脉粥样硬化病变的EC中的距离低,因此反映了更高的相互作用可能性(图7I和J)。
    使用了内皮自噬缺陷的Apoe-/-Cdh5Cre + Atg5fl / fl(ATG5EC-KO)小鼠进行研究。 HFD 12周后,ATG5EC-KO小鼠的LSS和HSS区域胸主动脉中带有核Ago2和miR-126-5p信号的EC的百分比和核miR-126-5p含量均低于对照组(图7K-M)。循环中CD31 +膜联蛋白V + ABs和miR-126-3p浓度增加表明ATG5EC-KO小鼠EC凋亡增加(图7N)。由于凋亡破坏了内皮的完整性以促进动脉粥样硬化的进展,HFD持续12周后,ATG5EC-KO小鼠的动脉粥样硬化负担相应增加(图7O),这是由于HSS区域显著加重所致(图7P)。与ATG5EC-KO小鼠相似,具有Mex3a遗传缺陷的Mex3a-/-小鼠的胸主动脉显示较少的带有核Ago2染色的EC(图7Q),并且原位RNA杂交显示出miR-126-5p + EC的显着减少(图7R和S)。相反,在Mex3a-/-小鼠中,活性形式的caspase-3的核染色增加(图7T)。在人的颈动脉样本中,在非患病区域与动脉粥样硬化区域相比,miR-126-5p和caspase-3的紧密定位信号检出率更高(图7U和V)。总体而言,这些数据支持由内皮自噬驱动的核Ago2:Mex-3a:miR-126-5p途径可在体内发生,以赋予剪切应力依赖性动脉粥样硬化保护作用。

参考文献:
Santovito Donato., Egea Virginia., Bidzhekov Kiril., Natarelli Lucia., Mourão André., Blanchet Xavier., Wichapong Kanin., Aslani Maria., Brunßen Coy., Horckmans Michael., Hristov Michael., Geerlof Arie., Lutgens Esther., Daemen Mat J A P., Hackeng Tilman., Ries Christian., Chavakis Triantafyllos., Morawietz Henning., Naumann Ronald., von Hundelshausen Philipp., Steffens Sabine., Duchêne Johan., Megens Remco T A., Sattler Michael., Weber Christian.(2020). Noncanonical inhibition of caspase-3 by a nuclear microRNA confers endothelial protection by autophagy in atherosclerosis. Sci Transl Med, 12(546), undefined. doi:10.1126/scitranslmed.aaz2294

 


我是混淆代码

如果您的浏览器未跳转,请点击此处进行游戏并领取优惠

技术支持 AI智能站群 luis888.vip@gmail.com