miRNA与散发性克雅氏病的血液诊断
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-11-16
散发性克雅氏病(sCJD)表现为一种传染性的,快速进行性痴呆,生存期短。代表性的病理特征是脑灰质海绵状变化,并伴有异常形式的朊病毒蛋白(PrP)的沉积...

    散发性克雅氏病(sCJD)表现为一种传染性的,快速进行性痴呆,生存期短。代表性的病理特征是脑灰质海绵状变化,并伴有异常形式的朊病毒蛋白(PrP)的沉积。脑核磁共振成像(MRI)和脑脊液(CSF)分析是常用的诊断方法。目前,还没有用于诊断或疾病监测的临床血液检测。miRNAs(microRNAs),可以抑制目标mRNA转录本的翻译并标记其降解。miRNA的失调已在疾病状态中被广泛描述。近期发表Nature Communications(IF=12.121)上的文章分析了sCJD中血液miRNA的表达,并评价了其作为sCJD诊断的价值。
技术路线图:

研究结果:
1.在sCJD血液中,小RNA测序鉴定5个差异表达miRNAs(DE miRNAs)
    病例对照研究57例sCJD患者和48例对照组的血液(表1)。测量了所有样本中的miRNAs。图1a显示,四个microRNA有统计上显著变化。图1b显示,与健康对照相比,sCJD中hsa-miR-16-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-106b-3p和hsalet-7i-5p下调,包括hsa-let-7d-3p。使用这五种差异表达的miRNA进行的无监督层次聚类分析产生了两个主要的样本聚类,大多数健康个体紧密地聚类在一起(图1c)。

2.sCJD 差异表达在独立队列中复制
    使用独立队列和技术验证和重复这些结果。重复队列包括29名sCJD患者和30名健康 (表1)。RT-qPCR检测显示sCJD血液中hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-93-5p水平较低,而hsa-miR-484如预期保持不变(图2a),与上述研究结果一致。在其余两种被检测的miRNA中,hsa-miR-106b-3p没有扩增,而hsa-let-7d-3p与上述结果不相符(图2a)。
    我们推测,如果差异miRNA表达在sCJD的外周病理生理中发挥作用,那么sCJD血液中的相关mRNA靶点也应该发生改变。我们使用TarBase鉴定这些mRNA靶点(使用荧光素酶分析和/或免疫沉淀验证);RT-qPCR检测重复队列中报道的由hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsamiR-93-5p控制的6个转录本的表达:CCND3、VEGFA、NAP1L1、ZFP36、CDKN1A和RNF44。图2b显示,与对照组的血液相比,sCJD患者的血样中有四个转录本水平升高,这与沉默miRNA之后靶mRNA的表达升高是一致的。对差异表达(DE)microRNA的六个靶点进行通路富集分析发现没有显著的富集。这些结果表明sCJD血液中hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsamiR-93-5p表达下调,同时其所对应的mRNA靶蛋白水平升高。

3.sCJD中,let-7i、miR-16和miR-93下调具有特异性
    为了进一步研究这种基于血液的miRNA标签与sCJD的相关性,我们分析AD患者的血液 (相当于sCJD患者第一次取样) 中hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-93-5p的水平。30个 AD患者的性别和年龄与对照组匹配用于复制分析(表1)。RT-qPCR数据表明,与sCJD形成鲜明对比,hsa-let-7i-5p, hsa-miR-16-5p和hsa- mir-93-5p在AD患者中升高(图3)。这些结果表明,血液中hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-93-5p的水平建立了一个标准,可以区分健康对照、AD和sCJD。

4.对sCJD血液中DE miRNA表达的纵向评价
    虽然疾病指标和DE miRNAs之间没有代表性的相关性,但我们猜想是否miRNA表达下降的速度与sCJD患者中观察到的下降速度有关。高的个体间变异可能会模糊随着时间的推移个体内的纵向影响。从21个sCJD个体纵向收集了50份血液(MRC朊病毒疾病评级量表评估每位患者的病情,以便监测疾病进展情况)。RT-qPCR检测的hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-93-5p和hsa-miR-484(sCJD血液中未发生变化)的表达水平,并将其转化为表达下降率。图4a-d显示,hsa-let-7i-5p、hsa-miR- 16-5p和hsa-miR-93-5p水平的下降率与疾病进展率(每天功能损失%)无关。

5. miRNA标记的诊断潜力
    为了评估miRNAs区分sCJD病例和健康对照的能力,进行了ROC分析。
    比较sCJD和健康对照,曲线下面积(AUCs)范围从0.736 (has-let-7i-5p)到0.762 (hsa-miR-16-5p),当三种miRNA合并时,曲线下面积(AUCs)达到0.788(图5a);在复制集中采用相同的方法,三种miRNAs聚合后的表现均优于各自的表现(图5b)。我们发现hsa-let-7i-5p, hsa-miR-16-5p和hsa-miR-93-5p是在AD患者中表达上调(相反,在sCJD中表达下调),接下来我们分别使用这三种miRNA并将其聚合,进行了同样的分析(即将AD与健康对照进行比较)。图5c显示,三种miRNA的曲线下面积(AUC)值在0.810 (hsa-miR-93-5p)到0.859 (hsa-miR-16- 5p)之间,三种miRNA的曲线下面积(AUC)之和达到0.860,具有较好的诊断鉴别性。最后,由于缺乏在血液中特异性和选择性地区分sCJD患者和AD患者的生物标志物,我们计算了sCJD和AD的AUCs比较。值得注意的是,曲线下面积(AUC)的范围为0.897 (hsa-miR-93-5p)至0.934 (hsa-let-7i-5p)。将这3个miRNA结合,曲线下面积(AUC)值为0.924,特异性为100%(图5d)。,这些结果表明,这些血液miRNA表达标记可用于区分AD和健康对照,sCJD和AD

总结:
    最后,miRNA在鉴别sCJD和阿尔茨海默病中显示了较高的准确性。这些发现突出了sCJD外周的分子改变,为鉴别诊断提供了信息,并提高了对人类朊病毒疾病机制的理解



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