METL14-澳门威斯尼人官网发展的靶点
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-12-15
澳门威斯尼人官网是人类最致命的癌症之一。N6甲基腺苷(m6A)是一种常见的真核细胞mRNA修饰,在生理和病理过程中起着重要作用......



澳门威斯尼人官网是人类最致命的癌症之一。N6甲基腺苷(m6A)是一种常见的真核细胞mRNA修饰,在生理和病理过程中起着重要作用。然而,它在澳门威斯尼人官网中的作用仍不清楚。今天小编为大家介绍一篇影响因子为15.302,发表于Molecular Cancer上的文章Upregulation of METTL14 mediates the elevation of PERP mRNA N6 adenosine methylation promoting the growth and metastasis of pancreatic cancer。在本文中,我们发现 METTL14的上调可以通过m6A修饰降低PERP水平,促进澳门威斯尼人官网的生长和转移,因此METTL14是其治疗的潜在靶点。

 


技术路线:

 

 

 

 结果:

1)澳门威斯尼人官网中m6A修饰水平升高

我们测量了澳门威斯尼人官网细胞系和人澳门威斯尼人官网组织标本中m6A的水平。值得注意的是,与人胰腺导管上皮(HPDE)细胞和正常胰腺组织相比,七种澳门威斯尼人官网细胞系中有五种细胞系的m6A水平升高(图1a)。类似地,大约70%的澳门威斯尼人官网组织中m6A水平高于配对的相邻组织(图1b)。此外,还分析了m6A水平与临床病理学的关系。总体生存率低与m6A水平增高显著相关(图1c),且与肿瘤表达水平低的患者相比,m6A表达水平较高的肿瘤患者淋巴转移显著增加(图1d)。

 

2)METTL14在澳门威斯尼人官网中的异常表达

为了阐明澳门威斯尼人官网中m6A水平升高的分子机制,我们评估了成对癌组织和邻近组织样本中最重要的m6A调节因子(METTL3METTL14WTAP)的表达。值得注意的是,实时PCR显示,与邻近的健康组织相比,澳门威斯尼人官网组织中的METTL3METTL14WTAP上调(图2a)。Western blot显示,与正常组织相比,澳门威斯尼人官网组织中METTL3 METTL14WTAP水平显著升高。(图2b)。然而,在复杂成分中,只有METTL14水平与患者生存率显著相关(图2c):METTL14水平升高与整体生存率差相关(图2c)。总之,这些数据表明METTL14是一个主要的m6A调节因子,参与澳门威斯尼人官网的临床病理学

 

 

 

3)METTL14上调促进澳门威斯尼人官网生长和转移

为了评估METTL14在澳门威斯尼人官网中的生物学作用,我们在人类澳门威斯尼人官网细胞系中过表达或敲除METTL14METTL14的缺失显著降低了m6A的水平(图2d)。METTL14基因敲除显著抑制PANC-1MIA-PaCa-2细胞的增殖和集落形成,而METTL14的异位表达增加了PANC-1BxPC-3细胞的增殖和集落形成(图3ab)。在裸鼠皮下和原位移植模型中,METTL14表达的增加促进了肿瘤的生长。相反,在这些模型中,METTL14的耗竭有效地抑制了肿瘤的生长(图3cd)。这些观察结果表明METTL14在体内外均能促进澳门威斯尼人官网的生长

接下来,我们研究了METTL14在澳门威斯尼人官网侵袭和转移中的作用。细胞迁移分析显示METTL14的缺失降低了PANC-1MIA-PaCa-2细胞的迁移和侵袭性,而过表达METTL14PANC-1BXPC-3细胞的作用则相反(图3e)。在创伤愈合分析中获得了类似的迁移数据(图3f)。我们用三种小鼠模型进一步研究了体内转移。在皮下植入模型中,我们观察到METTL14缺失或过表达分别显著减少或增加淋巴转移(图3g)。在原位移植模型中,METTL14的过表达显著加速了胰腺细胞向肝脏的转移,而METTL14的耗竭减少了肝转移(图3h)。此外,在小鼠肝转移模型中,METTL14的过表达导致肝转移显著增加并降低总生存率,而METTL14的耗竭减少了微转移的数量并延长了生存期(图3i)。这些数据表明METTL14在澳门威斯尼人官网的生长和转移中起着重要的促进作用。

 

  

4)利用RNA-Seqm6A-Seq识别METTL14下游靶标

为了研究METTL14在澳门威斯尼人官网中的调控作用,我们采用RNA-Seq分析PANC-1细胞、对照细胞和METTL14缺失细胞的基因表达谱。我们观察到,在METTL14基因敲除后,564个基因上调,715个基因下调(图4a)。 接着,我们使用m6A-Seq来绘制PANC-1细胞中具有生理(shCtrl)和降低(shMETTL14METTL14水平的m6A甲基体。与我们之前的数据一致,在对照和METTL14敲除细胞中,GGACU基序在m6A位点高度富集(图4b)。我们鉴定出22251124m6A修饰转录本的82387820m6A峰,其中来自1564463转录本的74967078个峰分别在对照细胞和METT L14敲除细胞中是唯一的(图4cd)。为了评估基因表达的改变是否是METTL14介导的甲基化(尤其是m6A)的结果,我们比较了来自RNA序列和m6A序列的数据。RNA序列鉴定出80个上调基因和108个下调基因显示m6A修饰,包括前6个水平升高的基因:EDN1GNALDNAH11ASS1PERP、和YIPF6(图4e)。

 

 

 

5)PERP是澳门威斯尼人官网重要的METTL14靶基因

为了进一步研究METTL14靶基因,我们验证了由RNA Seqm6A-Seq鉴定的6个上调的基因在METTL14缺失的PANC-1细胞中的表达。在这些靶点中,PERP mRNA和蛋白质水平在METTL14缺失时增加(图5ab)。为了证实PERP基因经过METTL14介导的m6A修饰,我们进行了甲基化RNA免疫沉淀定量PCRMeRIP-PCR。这些结果也表明METTL14可以使PERP基因甲基化(图5c)。在使用转录抑制剂放线菌素D处理后,METTL14基因敲除导致PERP转录半衰期显著增加(图5d)。通过分析我们从shMETTL14细胞获得的m6A序列数据以及从三个独立的m6A数据库(SRAMPRMBasem6Avar)检索到的附加信息,我们确定PERP3’-UTR中的一个唯一峰是METTL14的潜在靶点。用PERP 3’-UTR报告荧光素酶检测发现,METTL14的敲除大大提高了携带野生型PERP 3’-UTR的结构体的荧光素酶活性,而METTL14的过表达显著降低了携带野生型PERP 3’-UTR的结构体的荧光素酶活性。(图5e)。为了进一步研究PERPMETTL14表达之间的关系,我们在澳门威斯尼人官网组织中进行了免疫荧光分析,观察到高表达METTL14的肿瘤细胞显示PERP低表达,反之亦然(图5f)。

此外,作为m6A的第一个特征readerYT521-B同源域家族(YTH)蛋白质调节mRNA的稳定性和翻译。为了确定YTHDF2是否是PERP m6A甲基化的潜在读取器,我们敲除了YTHDF2,并观察到在胰腺细胞中PERP表达显著增强(图5g)。YTHDF2基因敲除不仅增加了PERP mRNA的水平和稳定性,而且在METTL14过表达的情况下也消除了它们的降低(图5hi)。这些结果表明PERPMETTL14的直接靶点,以m6A依赖的方式调节METTL14-YTHDF2-PERP

 

 


6)PERPMETTL14诱导澳门威斯尼人官网细胞生长和侵袭有关

为了了解PERPMETTL14诱导澳门威斯尼人官网生长中的作用,我们在METTL14缺失的澳门威斯尼人官网细胞中敲除PERP。我们发现PERP的耗竭显著提高了PANC-1细胞的活力和集落形成,但也消除了METTL14基因敲除后其下降的趋势(图6ab)。此外,transwell检测结果显示,PERP敲低也显著抵消了METTL14耗竭依赖对澳门威斯尼人官网细胞侵袭能力的抑制(图6c)。此外,我们构建了编码PERP-WTPERP的质粒,其具有特定的3’-UTR位点突变,并评估了它们(转染后)对过表达METTL14的澳门威斯尼人官网细胞的致瘤特性的影响。我们观察到METTL14的过表达降低了PERP的表达水平,增加了澳门威斯尼人官网细胞的集落形成和侵袭能力(图。6d-f)。然而,METTL14的过表达并不会影响过表达PERP并伴有3’-UTR突变的癌细胞(图。6d-f)。这些发现提示PERPMETTL14促进澳门威斯尼人官网生长的主要效应因子

 


结论:
我们的研究揭示了澳门威斯尼人官网中m6A甲基化水平的升高是由m6A调节剂METTL14的失调引起的。我们还通过PERP mRNA的靶向性研究了METL14在澳门威斯尼人官网生长和转移中的重要作用。目前的研究不仅为澳门威斯尼人官网发病机制的分子机制提供了新的见解,而且为开发针对m6A调节因子的澳门威斯尼人官网更有效的治疗策略铺平了道路。


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