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大鼠肺泡上皮澳门威斯尼人 澳门威斯尼人

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Sciencell研究实验室的大鼠肺泡上皮澳门威斯尼人是从出生2天大鼠的肺组织中分离得到的,原代冻存,冰冻运输。每管澳门威斯尼人密度超过1×10澳门威斯尼人6/ml。该澳门威斯尼人可通过CK-18、CK-19?及波形蛋白特异性抗体的免疫荧光鉴定。该澳门威斯尼人不含支原体、细菌、酵母菌和真菌。如采用ScienCell实验室特制的培养基,可保证此澳门威斯尼人继续增值。然而,由于人肺泡上皮澳门威斯尼人在接种之后会立即转变为I型肺泡上皮澳门威斯尼人且I型肺泡上皮澳门威斯尼人在培养中不会增殖,故不建议该澳门威斯尼人扩增或长期培养。

1、取得完全无血液残留的肺脏:

实验前将大鼠全身血液放净,取得完全无血液残留的肺脏。

2、消化肺组织:

常用于澳门威斯尼人消化的酶有胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶。胰蛋白酶是最早用于消化、分离上皮澳门威斯尼人的酶,现在一般用损伤性小的弹性蛋白酶来替代胰蛋白酶。但这种酶却有活性不稳定,有效作用时间短暂,容易自我降解等问题。Dobbs L G等认为弹性蛋白酶能更有选择性的消化分离上皮澳门威斯尼人[9]。

胰蛋白酶消化没有选择性,会带来像内皮澳门威斯尼人和间质澳门威斯尼人等一些不能在后面的分离步骤中去除的杂质澳门威斯尼人,因此弹性蛋白酶更有助于提高上皮澳门威斯尼人的纯度和产量。与此相反,Cunningham A C等发现,与弹性蛋白酶相比,用胰蛋白酶可以获得更大产量的Ⅱ型上皮澳门威斯尼人[10]。胶原酶可以用来辅助消化澳门威斯尼人间质。

用几种酶混合的方法比单一酶消化效果更好,但目前还没有文献定量描述最优化的酶消化方法。Finkelstein J N等发现可以通过支气管把酶灌注到完整的肺中消化,或把肺组织剪碎放入消化液中消化。前者比后者更有效。作者在自己的实验中也证实了通过支气管把酶灌注到完整的肺中消化效果更好。

3、分离纯化澳门威斯尼人:

上皮澳门威斯尼人的分离纯化技术经过二三十年的发展日渐成熟,呈现多样化的特点。目前对澳门威斯尼人的分离纯化主要有以下几种方法:

(1)密度梯度离心:

密度梯度离心分离澳门威斯尼人的原理是不同澳门威斯尼人的沉降系数不同,在密度梯度离心中澳门威斯尼人所处的位置也相应不同。这是最早用于分离Ⅱ型上皮澳门威斯尼人的方法,至今仍在使用。用ficoll或percoll不连续梯度离心,猪肺泡Ⅱ型澳门威斯尼人最终纯度可以达到70%-85%左右[11-12]。沉降系数与澳门威斯尼人的直径和天然密度有关。

由于Ⅱ型澳门威斯尼人与其他澳门威斯尼人存在密度和大小的交叉(如巨噬澳门威斯尼人),仅仅通过离心并不能有效去除杂澳门威斯尼人。Kikkawa(1974)让巨噬澳门威斯尼人吞噬一些重颗粒(如硫酸钡),改变其密度,可以帮助区分巨噬澳门威斯尼人和上皮澳门威斯尼人。离心后的纯度达到94%,但产量明显减少[8]。上皮澳门威斯尼人的大小和密度变化范围较大,用密度梯度离心要丢掉和其他澳门威斯尼人重叠的澳门威斯尼人层,这必然会造成某些密度大的Ⅱ型澳门威斯尼人损失,产量大大降低。

(2)滤膜分离:

滤膜分离的原理是根据澳门威斯尼人的大小不同来进行分离。Ⅱ型上皮澳门威斯尼人约10μm,比巨噬澳门威斯尼人(约25μm)和Ⅰ型澳门威斯尼人(50μm-100μm)小,用150μm孔径的滤膜初滤除去大的组织碎片,30 μm ~40 μm孔径的滤膜除去全部Ⅱ型澳门威斯尼人和部分巨噬澳门威斯尼人[13],采用15μm的滤膜精滤。用滤膜分离操作简单,它和其他分离方法联合使用可以提高纯度。

(3)流式澳门威斯尼人技术:

流式澳门威斯尼人技术分离的原理是根据不同澳门威斯尼人之间的荧光差异。根据不同种澳门威斯尼人的特征识别,用荧光物质标记筛选。上皮澳门威斯尼人内含有丰富的脂类物质,用亲脂性荧光素标记,可以得到纯度很高的澳门威斯尼人。Funkhouser J D等用抗Ⅱ型上皮澳门威斯尼人的单抗进行免疫荧光标记,再用流式澳门威斯尼人仪进行筛选,得到96%的Ⅱ型上皮澳门威斯尼人[14]。但荧光素对被标记澳门威斯尼人有害。Rochat T R等发现自然荧光和直角光散射可以区分巨噬澳门威斯尼人和单核澳门威斯尼人,这给不经荧光标记分离上皮澳门威斯尼人提供了可能[15]。流式技术分离澳门威斯尼人的产量很低,但纯度极高。这种技术经过完善在将来会更有吸引力。

(4)免疫黏附:

免疫黏附的原理是各种澳门威斯尼人的膜表面有不同的免疫活性物质。巨噬澳门威斯尼人和其他大多数非Ⅱ型澳门威斯尼人表面都有IgG上的Fc片段的受体。Uhal(1989)用IgG包被塑料板,把澳门威斯尼人悬液置于板上,巨噬澳门威斯尼人和其他大多数非Ⅱ型澳门威斯尼人因为含有Fc片段的受体而与IgG结合,吸附到板上,不黏附的Ⅱ型澳门威斯尼人被冲洗下来[16]。经过多年的摸索,这种方法近几年已开始应用,简便易行,可除去绝大多数的巨噬澳门威斯尼人,有效的提高上皮澳门威斯尼人的纯度。

(5)贴壁选择:

贴壁选择的原理是各种澳门威斯尼人完成贴壁的时间不同,这种特性用在培养时做筛选。根据最终目的,综合其中几种方法能达到较好的效果。例如先用滤膜过滤,再用IgG包被法。


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